Deze video demonstreert de inductie van lytische replicatie in een profaag die is geïntegreerd in het bacteriële genoom en het vastleggen van veranderingen in genexpressie via tijdgebonden bemonstering voor transcriptomische analyse.
Methodenartikel
Inductie van de lytische replicatie van de profage voor transcriptoomanalyse
10 weergaven
⸱
30 september 2026
In dit artikel
Samenvatting
Protocol
1 . Voorbereiding van niet-geïnduceerde en geïnduceerde lysogene culturen voor RNA- (ribonuclezuur)extractie
- Stel een verse overnight-kweek op door een enkele kolonie van de lysogeen te inoculeren in 5 mL LB en incubeer deze bij 37 °C onder schudden (180 rpm (omwentelingen per minuut)) gedurende 18–24 u.
- Subcultiveer de overnight-kweek in 80 mL LB (Lysogeny broth) in een verhouding van 1:100 in acht kolven van 250 mL.
- Label de eerste kolf als “niet-geïnduceerd” en de overige als “geïnduceerd”, samen met de tijdstippen waarop elk monster geoogst moet worden (bijv. “geïnduceerd t = 0”, “geïnduceerd t = 10 min”, “geïnduceerd t = 20 min”, enz.; (Figuur 1).
- Voeg na 90 min incubatie, wanneer de OD (optische dichtheid) 600 tussen 0,1–0,2 ligt, of op het moment van minimale spontane inductie (zie de discussie), 4 µL 1% ijsazijn (v/v) toe aan de niet-geïnduceerde kolf (Figuur 1).
OPMERKING: Aangezien het inducerende agens in dit werk is gemaakt met 1% ijsazijn als oplosmiddel, werd dezelfde hoeveelheid oplosmiddel alleen toegevoegd als controlestap. Afhankelijk van de preparatie van verschillende induceerders kunnen alternatieve controles worden overwogen. - Voeg de 80 mL kweek uit de niet-geïnduceerde kolf toe aan 720 mL steriele LB en voeg onmiddellijk de stopoplossing (ijskoud 5% [v/v] fenol, pH 4,3, 95% [v/v] ethanol) toe in een volume dat 20% van het kweekvolume bedraagt (160 mL), en incubeer op ijs gedurende minimaal 30 min en maximaal 2 u om de RNA-transcripten te stabiliseren. Dit is het niet-geïnduceerde monster.
- Induceer de resterende kweken in zeven kolven van 250 mL (Figuur 1) met de FMIC (finale minimale inhiberende concentratie) van een geschikt inducerend agens (in dit geval 25 mg·mL⁻¹ norfloxacine, geprepareerd in 1% ijsazijn [w/v], gebruikt bij een finale concentratie van 1 µg·mL⁻¹), meng goed en incubeer bij 37 °C onder schudden op 180 rpm gedurende 1 u.
OPMERKING: Deze stap dwingt de lysogene kweek in een gecoördineerde staat van lytische replicatie. De meeste cellen in de kweek zullen beginnen met de lytische productie van infectieuze faagdeeltjes. - Laat de cellen herstellen door 80 mL kweek uit de geïnduceerde kolf toe te voegen aan 720 mL steriele LB, waardoor het inducerende agens effectief wordt verdund. Oogst de bacteriële cellen uit elke kolf elke 10 min vanaf tijdstip 0 tot 1 u door een stopoplossing toe te voegen, zoals vermeld in stap 1.5.
OPMERKING: De stopoplossing stabiliseert het RNA tot 2 u. Voer echter alle verdere stappen uit bij 4 °C om de stabiliteit van het monster te vergroten. - Oogst door centrifugatie bij 10.000 x g gedurende 15 min bij 4 °C zo snel mogelijk, uiterlijk 2 u na de behandeling, om RNA-degradatie te voorkomen.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de bacteriële pellets voorzichtig in de resterende vloeistof met een verstelbare automatische pipet voordat elk monster wordt overgebracht naar een microcentrifugebuisje van 1,5 mL.
- Centrifugeer de microcentrifugebuisjes op hoge snelheid (13.000 x g) in een microcentrifuge bij 4 °C gedurende 1 min en verwijder het resterende supernatant.
- Bevries de pellets direct (flash-freeze) door elk afgesloten microcentrifugebuisje in vloeibare stikstof te dompelen. Dit bevordert de efficiënte lysis van de cellen voor RNA-extractie.
- Voeg TRIzol (1 mL) toe aan elke bevroren pellet en homogeniseer de suspensie door te pipetteren (niet vortexen). Bewaar bij −80 °C totdat de RNA-extractie voor alle monsters kan worden uitgevoerd.
OPMERKING: Het protocol kan op dit punt worden onderbroken. - Herhaal stappen 1.1–1.13 met drie biologische replica's.
Resultaten
Figuur 1: Het experimentele ontwerp voor het bemonsteren van geïnduceerde en niet-geïnduceerde culturen voor RNA-isolatie.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| LES-fagen | Geïnduceerd en gezuiverd uit LESB58 met gebruik van norfloxacine. | Deze studie | |
| Lysogeny Broth (LB) | Merck | 1.10285.500 | |
| Lysogeny Broth (LB) Agar | Merck | 1.10283.500 | |
| Agar Agar | Fisher | A/1080/53 | |
| Top Agar | 0,4 g Agar Agar + 2,5 g LB Broth in 100 mL water; autoclaveren en gebruiken. | - | |
| Rifampicine | Sigma (Voorraad: 50 mg/mL in methanol - goed mengen en een 0,22 µm filter gebruiken om te steriliseren en bewaren bij -20 °C tot gebruik) | R3501 | |
| IJszuur | Fisher 1% (v/v) in water | 10060000 | |
| Norfloxacine | Sigma (Voorraad: 25 mg/mL in 1% ijszuur - goed mengen en een 0,22 µm filter gebruiken om te steriliseren en bewaren bij -20 °C tot gebruik; bewaren in kleine aliquoten om vries-dooi-cycli te vermijden) | N9890 | |
| Fenol verzadigd met citraatbuffer pH 4,3 | Sigma | P-4682 | |
| Ethanol van moleculaire biologie-kwaliteit | Fisher | 16695992 | |
| TRIzol | Invitrogen | 12044977 | |
| Chloroform | Fisher | 11398187 | |
| Isopropanol | Fisher | 17150576 | |
| Nuclease-vrij water | Invitrogen | 10526945 |
