Oogsten van adeno-geassocieerd virus uit getransfecteerde zoogdiercellen

Samenvatting

Bron: Rghei, A. D., et al. Production of Adeno-Associated Virus Vectors in Cell Stacks for Preclinical Studies in Large Animal Models. J. Vis. Exp. (2021)

Deze video demonstreert het terugwinnen van ruw adeno-geassocieerd virus uit getransfecteerde zoogdiercellen middels chemische lyse en centrifugatie, wat een hoge opbrengst van AAV mogelijk maakt voor verdere zuivering en preklinische gentherapie-toepassingen.

Protocol

1. Oogsten van AAV (adeno-geassocieerd virus) en chemische lysis van de getransfecteerde HEK293-cellen (menselijke embryonale nier 293)

1. Schud de celkweekkamer krachtig om de cellen los te maken totdat het medium troebel wordt door de losgekomen cellen en giet dit in vier centrifugebuizen van 500 mL.
2. Centrifugeer de buizen bij 18,000 x g gedurende 30 min bij 4 °C om de cellen te pelletteren. Giet het geklaarde supernatant in een PETG-fles (polyethyleentereftalaat-copolyester) van 1 L.OPMERKING: Indien een hogesnelheidscentrifuge niet beschikbaar is, centrifugeer dan bij 12,000 x g gedurende 40 min. De gepelletteerde cellen zijn bij deze snelheid mogelijk niet solide en kunnen wegglijden bij het uitgieten van het supernatant.
3. Resuspendeer de celpellets in 500 mL centrifugebuizen met 50 mL lysisbuffer en incubeer gedurende 60 min bij 37 °C.
4. Centrifugeer de buizen bij 18,000 x g gedurende 30 min en breng vervolgens het supernatant over in dezelfde PETG-fles van 1 L. Verwijder het gepelletteerde celdebris.OPMERKING: Zuiver het geklaarde supernatant onmiddellijk en bewaar dit bij 4 °C voor maximaal 72 u. Voor langere bewaring bewaren bij -80 °C. Niet bewaren bij -20 °C.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
10-kamer cellstack	Corning	3271
1L PETG-fles	Thermo Fisher Scientific	2019-1000
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) met 1000 mg/L D-glucose, L-glutamine	Cytiva Life Sciences	SH30022.01
Fetaal runderserum (FBS)	Thermo Fisher Scientific	SH30396.03
HEK293-cellen	American Tissue Culture Collection	CRL-1573	Ontdooi de cellen bij ontvangst en kweek ze zoals beschreven in het protocol van de fabrikant. Zodra de cellen minimaal zijn gepassaged en goed groeien, wordt een subfractie in aliquoten ingevroren voor toekomstig gebruik en bewaard in vloeibare stikstof. Gebruik altijd cellen met een passagenummer lager dan 30. Wanneer gekweekte cellen meer dan 30 keer zijn gepassaged, wordt aangeraden om een nieuwe kweek te starten vanuit de bewaarde aliquoten
Ondersteuningskussen voor centrifugebuizen met groot volume	Corning	CLS431124	Het ondersteuningskussen moet worden gebruikt bij centrifugebuizen met groot volume, tenzij de centrifugerotor over de juiste V-bodemkussens beschikt
Centrifugebuizen met groot volume	Corning	CLS431123-6EA	500 mL centrifugebuizen