Affiniteitschromatografische zuivering van adeno-geassocieerde virusvectoren

Samenvatting

Bron: Rghei, A. D., et al. Production of Adeno-Associated Virus Vectors in Cell Stacks for Preclinical Studies in Large Animal Models. J. Vis. Exp. (2021)

De video demonstreert de zuivering van recombinante adeno-geassocieerde virus (AAV) vectoren uit ruw gastheerlysaat met behulp van een op heparine gebaseerde affiniteitsmatrix. Virale deeltjes binden aan geïmmobiliseerde heparine, terwijl onzuiverheden worden weggewassen. Een buffer met een hoog zoutgehalte laat intacte virussen vrij, die worden opgevangen in verrijkte fracties. Deze fracties worden geconcentreerd door membraancentrifugatie en gespoeld om resterende deeltjes terug te winnen, wat resulteert in gezuiverde AAV-vectoren met een hoge titer.

Protocol

1. Dubbele plasmidtransfectie van HEK293-cellen in celstacks

1. Ontdooi een cryovial met Human Embryonic Kidney 293 (HEK293) cellen in een kraalbad ingesteld op 37 °C.
   OPMERKING: Warm het complete Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) vooraf op tot 37 °C terwijl de cellen ontdooien om koudeshock tijdens het uitplaten te voorkomen. Zorg dat de cellen een laag passagenummer hebben, bij voorkeur minder dan 20, om een optimale groei en transfectie-efficiëntie te garanderen. Controleer of de cellen gecertificeerd zijn als mycoplasma-vrij.
2. Overbreng de inhoud van de cryovial druppelgewijs naar een conische buis van 15 mL met 10 mL voorverwarmd compleet DMEM en centrifugeer de cellen bij 500 × g gedurende 5 min.
3. Aspireer het medium en resuspendeer de HEK293 cellen vervolgens in 20 mL voorverwarmd compleet DMEM. Zaai de cellen uit in een plaat van 15 cm en incubeer bij 37 °C, met 5% CO₂.
4. Splits de cellen van één plaat van 15 cm over drie platen voor uitzaai in de celkweekkamer.
   1. Zodra de cellen 80% confluent zijn, aspireer het medium en was de plaat voorzichtig met 3 mL fosfaatgebufferde saline (PBS) om de monolaag niet te verstoren. Aspireer vervolgens de PBS en voeg 3 mL trypsine toe.
   2. Incubeer 2 min bij 37 °C totdat de cellen loslaten van de plaat, en neutraliseer de trypsine vervolgens door 7 mL compleet DMEM aan de plaat toe te voegen.
   3. Verzamel al het medium en de cellen in een buis van 15 mL en pelletteer de cellen door te centrifugeren bij 50 × g gedurende 5 min.
   4. Aspireer het supernatant uit de buis van 15 mL en resuspendeer de celpellet in 3 mL compleet DMEM. Voeg 1 mL toe aan elke plaat van 15 cm die 20 mL compleet DMEM bevat; schud de platen voorzichtig om de cellen gelijkmatig te verdelen en incubeer bij 37 °C, met 5% CO₂.
5. Zodra de cellen 80% confluent zijn, herhaal stappen 1.4.1 en 1.4.2. Verzamel het supernatant in conische buizen van 50 mL en keer de buis voorzichtig om te garanderen dat de cellen homogeen zijn.
6. Bepaal de celdichtheid door 10 µL van de celmonsters te mengen met 10 µL trypaanblauw en voeg het mengsel toe aan een telplaat voor analyse in de celsteller.
7. Meng 1 L voorverwarmd compleet DMEM met de benodigde celsuspensie om de celkweekkamer (oppervlakte van 6360 cm²) te zaaien met 1 × 10⁴ cellen/cm². Giet het celmengsel in de celkweekkamer en roteer voorzichtig om de cellen gelijkmatig over elke monolaag te verdelen (Figuur 1) en incubeer bij 37 °C, met 5% CO₂.
8. Plateer, naast de celkweekkamer, een plaat van 15 cm met 1 × 10⁴ cellen/cm² als referentie voor de confluentie.
9. Controleer na een incubatie van ~65 uur de referentieplaat op confluentie — bij voorkeur ~80%-90% confluent.
   OPMERKING: Warm het complete DMEM dat aan de celkweekkamer wordt toegevoegd vooraf op tot 37 °C.
10. Bereid een polyethyleenimine (PEI)/DNA-mengsel voor bij een concentratieverhouding van 3:1 (w/w).
    1. Bereid het DNA-mengsel in een conische buis van 50 mL door 475 µg pTrangene en 1425 µg pHelper toe te voegen aan 40 mL serumarm medium om een 3:1 verhouding van pHelper:pTrangene te creëren.
       OPMERKING: De calculator voor het PEI/DNA-mengsel is te vinden in Tabel 1.

Transfectie van de celkweekkamer
Protocol
1. Laat het DNA, OptiMEM en PEI vóór de transfectie opwarmen tot kamertemperatuur
2. Voer het aantal te transfecteren cellstacks in (geen overschot vereist)
3. Controleer of de DNA-concentraties correct zijn, aangezien dit de benodigde volumes zal beïnvloeden
Aantal celkweekkamers		1
Concentratie van transgene plasmide		1	mg/mL
Concentratie van pDGM6.2FF-plasmide		1	mg/mL
		Hoeveelheid per celkweekkamer		Transfectie-mastermix
	OptiMEM	48.1	mL	48.1	mL
1:3 ratio pTransgene:pHelper	pTransgeen	475	µg	475	µL
	pHelper	1425	µg	1425	µL
4. Voeg de benodigde volumes OptiMEM en plasmide-DNA toe aan een conische buis van 50 mL
5. 10 keer omkeren om te mengen
3:1 PEI:DNA-ratio	PEI Max	5.7	ml	5.7	mL
6. Voeg de benodigde hoeveelheid PEI toe aan de 50 mL buis die OptiMEM en plasmid-DNA bevat
7. Sluit de buis van 50 mL onmiddellijk en vortex en keer deze 3–5 keer om om te mengen.
8. Stel een timer in op 10 min voor de incubatie van de PEI-complexen
9. Verplaats de te transfecteren celstacks naar de biologische veiligheidskabinet (BSK)
10. Giet na 10 min het transfectiemengsel in één oranje poort.
1. Meng de vloeistof voorzichtig door de cellstack
12. Plaats de stack met getransfecteerde cellen terug in de incubator en zorg voor een gelijk volume op elke laag
13. Oogst de celkweekkamer na 72 uur

Tabel 1: Transfectiecalculator voor celkweekkamer. Interactief werkblad om de juiste concentratie van pTransgene, pHelper en PEI te bepalen voor transfectie van de celkweekkamer.

2. Voeg 5,7 mL PEI (1 g/L) druppelsgewijs toe aan het serumarm medium en het DNA-mengsel. Vortex vervolgens kort en incubeer gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
OPMERKING: Tijdens het incuberen van PEI/DNA bij kamertemperatuur zal het mengsel licht troebel worden.

11. Verwijder na 8 min incubatie van PEI/DNA het medium uit de celkweekkamer.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat beide oranje doppen worden losgedraaid om een gelijkmatige doorstroming van het medium te behouden en te voorkomen dat cellen loslaten.
12. Voeg PEI/DNA toe aan 1 L voorverwarmd compleet DMEM en giet het mengsel langzaam in de poort van de celkweekkamer. Verdeel de vloeistof gelijkmatig over alle rijen (Figuur 1) en incuberen gedurende 72 u bij 37 °C, met 5% CO2₂.

2 Oogsten van adeno-geassocieerde virus (AAV) en chemische lysis van de getransfecteerde HEK293-cellen

1. Schud de celkweekkamer krachtig om de cellen los te maken totdat het medium troebel wordt door de losgekomen cellen en giet dit in vier centrifugebuizen van 50 mL.
2. Centrifugeer de buizen gedurende 30 min bij 18.0 × g bij 4 °C om de cellen te pelletteren. Giet het geklaarde supernatant in een PETG-fles (polyethyleentereftalaat-copolyester) van 1 L.
   OPMERKING: Als er geen toegang is tot een hogesnelheidscentrifuge, centrifugeer dan gedurende 40 min bij 12.00 × g. De gecentrifugeerde cellen zijn bij deze snelheid mogelijk niet volledig vast en kunnen verschuiven tijdens het uitgieten van het supernatant.
3. Resuspendeer de celpellets in centrifugebuizen van 50 mL met 50 mL lysisbuffer en incubeer gedurende 60 min bij 37 °C.
4. Centrifugeer de buizen gedurende 30 min bij 18.0 × g en breng vervolgens het supernatant over in dezelfde PETG-fles van 1 L. Verwijder de gepelletteerde celresten.
   OPMERKING: Zuiver het geklaarde supernatant onmiddellijk en bewaar het tot 72 u bij 4 °C. Voor langdurige bewaring bewaren bij -80 °C. Niet bewaren bij -20 °C.

3 Zuivering van AAV-vectoren met behulp van heparine-affiniteitschromatografie

1. Haal het ruwe lysaat uit -80 °C en laat het gedurende de nacht bij 4 °C ontdooien. Gebruik na het ontdooien een 0,2 µM filter om het ruwe lysaat te filteren.
2. Om de centrifugeerconcentrator te passiveren, wordt 4 mL filter-voorbehandelingsbuffer toegevoegd aan een centrifugeerconcentrator voor elke gebruikte heparine-sefarosekolom. Passiveer de centrifugeerconcentrator gedurende 2-8 u bij kamertemperatuur. Start de passivering direct voorafgaand aan de zuiveringsstappen.
3. Stel de slang en de pomp in (Figuur 2).
   1. Plaats de slang in een peristaltische pomp en laat 20 mL 1 M NaOH doorstromen. Laat vervolgens 50 mL water van moleculaire graad doorstromen, gevolgd door 50 mL basaal DMEM.
   2. Bevestig de 5 mL heparine-sefarosekolom aan de slang en laat 25 mL basaal DMEM doorstromen om het conserveermiddel te verwijderen.
4. Laat 0,2 µM van het gefilterde ruwe lysaat door de kolom stromen bij een stroomsnelheid van 1-2 druppels/s.

OPMERKING: Zorg ervoor dat er geen luchtbellen ontstaan en dat de kolom niet droog komt te staan, aangezien dit de kolom beschadigt en de elutie van AAV verhindert. Gooi de kolom weg als deze droog is komen te staan en gebruik een nieuwe kolom voor het resterende ruwe lysaat.

5. Laad het volledige ruwe lysaat op de heparinekolom en gebruik de volgende oplossingen om de kolom te wassen.
   1. Was met 50 mL 1× Hank's Balanced Salt Solutions (HBSS) zonder Mg²⁺ en Ca²⁺.
   2. Was met 15 mL 0,5 % N-lauroylsarcosine in HBSS zonder Mg²⁺ en Ca²⁺.
   3. Was met 50 mL HBSS zonder Mg²⁺ en Ca²⁺.
   4. Was met 50 mL HBSS met Mg²⁺ en Ca²⁺
   5. Was met 50 mL 20 mM NaCl/HBSS met Mg²⁺ en Ca²⁺.
   6. Elueer 5 × 5 mL (totaal 25 mL) met 300 mM NaCl/HBSS met Mg²⁺ en Ca²⁺ en label de eluaties als E1-E5 (elke elutie is 5 mL).
6. Concentreren van het virus met een centrifugale concentrator
   1. Centrifugeer de centrifugale concentrator met de voorbehandelingsbuffer bij 900 × g gedurende 2 min. Gooi het doorstroomvolume weg.
   2. Was het filter van de centrifugale concentrator met 4 mL HBSS met Mg²⁺ en Ca²⁺ en centrifugeer bij 10 × g gedurende 2 min; gooi het doorstroomvolume weg.
   3. Voeg elutie E2 toe aan de centrifugale concentrator. Centrifugeer bij 10 × g gedurende 5 min en gooi het doorstroomvolume weg.
   4. Voeg de rest van E2 toe en voeg vervolgens E3 toe aan de centrifugale concentrator en centrifugeer bij 10 × g gedurende 5 min totdat het geconcentreerde virus ongeveer 1 mL is.
      OPMERKING: Vermijd centrifugeren van de vector zodanig dat het volume onder het niveau van het filter komt. Concentreer E1, E4 of E5 niet in de centrifugale concentrator, aangezien deze zeer weinig tot geen vector bevatten en contaminanten bevatten.
   5. Verwijder het geconcentreerde virus uit de centrifugale concentrator met een gefilterde p20-pipetpunt en plaats het in een steriele centrifugebuis van 1,5 mL.
   6. Spoel de centrifugale concentrator met 20 µL HBSS met Mg²⁺ en Ca²⁺ om eventueel resterend AAV van het filter te verwijderen. Pipetteer meerdere keren krachtig op en neer (gedurende ~30 s) om elk aan het membraan gehecht virus los te maken en plaats dit in de 1,5 mL centrifugebuis bij de rest van het virus. Meng de buis goed.
   7. Neem een aliquot van 5 µL voor DNA-extractie en bewaar de gezuiverde vector bij -80 °C.
7. Was de kolom met 25 mL 2 M NaCl. Gebruik vervolgens 25 mL 0,1% Triton X-10, vooraf verwarmd tot 37 °C, om de kolom te wassen. Was de kolom daarna met 50 mL steriel dH₂O en vervolgens met 25 mL 20% ethanol.
8. Zorg dat het kolommembraan volledig verzadigd is in 20% ethanol, aangezien dit de bewaaroplossing is. Sluit de kolom af met de meegeleverde pluggen en bewaar bij 4 °C.
9. Bewaar de slangjes in 1 M NaOH.
   OPMERKING: Indien correct gereinigd, kunnen heparine-sefarosekolommen tot vijf keer worden hergebruikt.

Resultaten

Figuur 1: Hanteren van de cellstack voor het uitzaaien van cellen en transfectie. Voor het uitzaaien in de cellstack begint u met het verwijderen van een van de ontluchtingsdoppen en het inschenken van 1 L voorverwarmd compleet Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) met de benodigde hoeveelheid HEK293-cellen (A). Verdeel de cellen en het medium gelijkmatig door beide ontluchtingsdoppen vast te draaien; breng vervolgens al het medium naar de hoek van de cellstack met behulp van een van de ontluchtingsdoppen en plaats deze in die hoek (B), plaats de cellstack op zijn zijkant (C) en draai de cellstack vervolgens 90° (D) zodat de ontluchtingspoorten naar boven wijzen (E). Laat de cellstack voorzichtig zakken naar de normale horizontale positie en zorg ervoor dat alle kamers van de cellstack volledig bedekt zijn met medium (F). Bij transfectie draait u beide ontluchtingsdoppen los en giet u het oude medium langzaam leeg in een steriele afvalbak, waarbij een gelijkmatige stroom wordt aangehouden om de monocultuur van de cellen niet te verstoren (G).

Figuur 2: Opstelling van de peristaltische pomp voor zuivering van adeno-geassocieerde virussen (AAV). Leid de slang vanaf het ruwe lysaat, door de peristaltische pomp en in de heparinematrixkolom.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.22 μm Filter	Millipore Sigma	S2GPU05RE
0,25% trypsine	Fisher Scientific	SM201C
Cellstack met 10 kamers	Corning	3271
1L PETG-fles	Thermo Fisher Scientific	2019-1000
Celkweekschaaltjes	Greiner bio-one	7000232	platen van 15 cm
Conische kweekbuis	Thermo Fisher Scientific	339650	15 mL conische buis
Conische kweekbuis	Fisher Scientific	14955240	50 mL conische buis
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) met 100 mg/L D-glucose, L-glutamine	Cytiva Life Sciences	SH302.01
Ethanol	Greenfield	P016EA95	Verdun ethylalcohol (95% vol) tot 20% voor sectie 3.7.4
Foetaal kalfsserum (FBS)	Thermo Fisher Scientific	SH30396.03
Hank's Balanced Salt Solutions (HBSS) met Mg²⁺ en Ca²⁺	Thermo Fisher Scientific	SH302268.02
Hank's Balanced Salt Solutions (HBSS) zonder Mg²⁺ en Ca²⁺	Thermo Fisher Scientific	SH3058.02
HEK293-cellen	American Tissue Culture Collection	CRL-1573	Ontdooi de cellen bij ontvangst en kweek deze volgens het protocol van de fabrikant. Zodra de cellen minimaal zijn gepasseerd en goed groeien, wordt een subfractie in aliquoten ingevroren voor toekomstig gebruik en bewaard in vloeibare stikstof. Gebruik altijd cellen met een passagenummer lager dan 30. Wanneer gekweekte cellen meer dan 30 keer zijn gepasseerd, wordt aanbevolen om een nieuwe kweek te starten vanuit de bewaarde aliquoten.
Heparinsulfaatkolom	Cytiva Life Sciences	17040703
Ondersteuningskussen voor centrifugebuizen met groot volume	Corning	CLS431124	Een ondersteuningskussen moet worden gebruikt bij centrifugebuizen met een groot volume, tenzij de centrifugerotor over de juiste V-bodemkussens beschikt.
Centrifugebuizen voor grote volumes	Corning	CLS431123-6EA	50 mL centrifugebuisjes
Microcentrifugebuisje	Fisher Scientific	05-408-129	1,5 mL microcentrifugebuisje, vóór gebruik steriliseren
Water van moleculaire kwaliteit	Cytiva Life Sciences	SH30538.03
N-lauroylsarcosine natriumzout	Sigma Aldrich	L5125	WAARSCHUWING. Draag handschoenen
NaCl	Thermo Fisher Scientific	BP35810
Optimem, medium met verlaagd serumgehalte	Thermo Fisher Scientific	31985070
Pasteurpipetten	Fisher Scientific	13-678-20D	Steriliseren voor gebruik
Fosfaatgebufferde zoutoplossing (10x)	Thermo Fisher Scientific	70011044	Verdunnen tot 1x voor gebruik op cellen
Penicilline-streptomycine-oplossing	Cytiva Life Sciences	SV3010
pHelper-plasmide	De novo ontwerp of verkregen uit een plasmidenrepository	N.v.t.
Pipetbakje	Thermo Fisher Scientific	13-681-502	Koop steriele pipetbakken
Polyethyleenglycol tert-octylfenylether (Triton X-10)	Thermo Fisher Scientific	9002-93-1	WAARSCHUWING. Draag handschoenen
Polyethylenimine (PEI)	Polyscience	24765-1	Volg de instructies van de fabrikant om een oplossing van 1 L te bereiden. 0.22μm filteren en bewaren bij 4°C
pTrangene-plasmide	De novo ontwerp of verkregen uit een plasmidenrepository	N.v.t.	Moet SV40 polyA in het genoom bevatten om compatibel te zijn met de AAV-titratie in sectie 5.0
Pompslang	Cole-Parmer	RK-9640-14	Optimaliseer de lengte van de slang en de insluiting van het virus in fracties E1-E5
Natriumhydroxide (NaOH)	Thermo Fisher Scientific	SS26-4
Trypanblauw	Bio-Rad	1450021