Lentivirale vector-gebaseerde transductie van bevruchte rattenembryo's

Samenvatting

Bron: Koza, P., et al. Generation of Transgenic Rats using a Lentiviral Vector Approach. J. Vis. Exp. (2020)

Deze video demonstreert de via micro-injectie ondersteunde aflevering van lentivirale vectoren in bevruchte rattenembryo's om stabiele integratie van het transgen te bereiken voor de generatie van transgene ratten.

Protocol

Alle procedures met dierlijke monsters zijn beoordeeld en goedgekeurd door dedesbetreffende commissie voor dierethiek.

1. Micro-injectie van lentivirale vectoren in embryo's in het ééncelstadium onder de zona pellucida
   OPMERKING: Gebruik embryo's in het ééncelstadium met twee zichtbare pronuclei voor de micro-injectie (Afbeelding 1).
   1. Ontdooi het aliquot lentivirus (LV) bij kamertemperatuur en centrifugeer bij 10.000 x g en kamertemperatuur (RT) gedurende 2 min om eventuele resterende cellulaire debris te pelletteren.
   2. Opstelling voor micro-injectie
      1. Bereid glazen houdpipetten (borosilicaatglascapillair) voor met een microforge. Trek het glazen capillair over een vlam om een tip van 5–10 cm te creëren. Breek de pipet zodat er een tip van ~4 cm overblijft. De buitendiameter moet ~80–120 µm zijn.
         OPMERKING: Zorg ervoor dat de pipetpunt perfect recht en glad is.
      2. Plaats de getrokken pipet in een microforge met de punt voor het verwarmingselement. Verhit het element zeer dicht bij de pipetpunt en laat deze krimpen tot een diameter van ~15 µm (ongeveer 20% van de grootte van het embryo). Positioneer de pipet loodrecht op het verwarmingselement, 2–3 mm vanaf de pipetpunt, en begin met verhitten. Het glas zal zacht worden. Verhit tot een hoek van 15° is bereikt.
      3. Bereid borosilicaatglascapillairs voor micro-injectie met een filament met behulp van een pipette puller. Plaats het capillair in de trekkamer. Voer een ramp-test uit (voor de eerste keer bij nieuw glas en telkens na het vervangen van het filament). Stel Heat in op de ramp-waarde -10, Pull op 100, Velocity op 150 en Time op 100.
         OPMERKING: Pas de parameters aan om een optimale injectiecapillair te verkrijgen.
      4. Laad onder een biosafety laminair flow-kast ongeveer 2 µL van de virale oplossing in de micro-injectiepipet met een microloader-tip.
      5. Bereid een micro-injectieschaaltje voor (deksel van een 60 mm Petrischaal) met een druppel van 100 µL M2-medium (in het midden), afgedekt met vloeibare paraffine of minerale olie.
      6. Bevestig de houdpipet en het met virale oplossing gevulde micro-injectiecapillair aan een micromanipulator en het micro-injectieschaaltje onder een omgekeerde microscoop.
   3. Uitvoeren van de micro-injectie
      1. Breng 15–20 embryo's in het ééncelstadium over naar de M2-druppel op het micro-injectieschaaltje. Houd het embryo vast met een houdpipet.
      2. Injecteer bij 400x vergroting de LV-oplossing onder de zona pellucida in de perivitelline ruimte met het glazen capillair dat is aangesloten op een automatische injector. Houd het capillair een moment onder de zona pellucida.
         OPMERKING: Door gebruik van een zachte positieve druk zal de virale oplossing continu uit de injectiecapillair stromen, maar het volume van de afgeleverde suspensie kan niet worden gecontroleerd.
      3. Breng de embryo's met een fijne pipet terug naar de kweekschaal in de incubator bij 37 °C in een 5% CO₂ atmosfeer. Het aantal injecties per zygote kan variëren en kan worden aangepast op basis van de concentratie van de virale vector.
         OPMERKING: De geïnjecteerde embryo's kunnen in het ééncelstadium worden overgebracht naar pleegmoeders of overnight (O/N) worden geïncubeerd in M16-medium voordat ze in het tweecelstadium worden overgebracht. Langdurige in vitro kweek van rattenembryo's dient te worden vermeden.

Resultaten

Afbeelding 1. Microscopische foto van een rattenembryo in het eencellige stadium dat werd voorbereid voor subzonale injectie van een lentivirale vector. Het embryo werd geïmmobiliseerd met een holdingpipet. Twee pronuclei die maternaal en paternaal genetisch materiaal bevatten en het pollichaam zijn zichtbaar. Schaalbalk = 20 μm.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Aspiratiebuisassemblages voor gekalibreerde microcapillaire pipetten	Sigma	A5177-5EA
Borosilicaatglazen capillairen met filament GC100TF-15	Harvard Apparatus Limited	30-0039	Injectiecapillair
CELLSTAR weefselcelkweekschaal 35 mm	Greiner Bio-One	627160
CELLSTAR weefselcelkweekschaal 60 mm	Greiner Bio-One	628160
Minerale olie	Sigma	M8410-500ML
Inverteerde microscoop	Zeiss	Axiovert 200
M2 medium	Sigma	M7167
VacuTip	Eppendorf	5175108	Vasthoudcapillair
M16 medium EmbryoMax	Sigma	MR-016-D