Zuivering van virale integrase met behulp van affiniteitschromatografie

Samenvatting

Bron: Lopez Jr., M. A., et al. Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase. J. Vis. Exp. (2017)

Deze video demonstreert de zuivering van polyhistidine-getagde virale integrase met behulp van nikkelaffiniteitschromatografie. Het protocol maakt gebruik van imidazolgradiënt-elutie om de integrase selectief te isoleren op basis van de affiniteit voor nikkelgeladen hars.

Protocol

1. Nikkelaffiniteitschromatografie

1. Ontdooi één bacterieel pellet op ijs.
   OPMERKING: Dit zal aanzienlijk veel tijd in beslag nemen (ongeveer 2 - 3 u). Wanneer het pellet is ontdooid tot een celsuspensie, voegt u nog eens 500 μM fenylmethansulfonylfluoride (PMSF) toe (100 mM stockoplossing).
2. Houd de 50 mL buis met bacteriesuspensie op ijs. Sonicate de bacteriën bij een amplitude van 30% gedurende 30 s (1 s aan, 1 s uit) per pellet afkomstig van 1 L cultuur met een sonicator met een bio-hoorn van 0,5 inch diameter met een taps toelopende microtip van 0,125 inch diameter, een frequentie van 20 kHz en een maximaal vermogen van 400 W.
3. Overbreng het celmonster naar een koude ultracentrifugebuis. Gebruik polycarbonaatflesassemblages (25 mm diameter, 89 mm hoogte) die compatibel zijn met een Type 60 Ti vaste hoekrotor. Alternatieve buizen en rotors kunnen worden gebruikt als dezelfde centrifugale kracht wordt bereikt. Centrifugeer 120.000 x g gedurende 60 min bij 4 °C. Er moet een duidelijk pellet zichtbaar zijn. Het supernatant kan een gele kleur hebben.
4. Overbreng het supernatant door te schenken of te pipetteren naar een koude conische buis van 50 mL. Noteer het volume; dit volume moet ongeveer gelijk zijn aan het volume resuspensiebuffer dat vóór het snap-freezen is gebruikt. Als het supernatant viskeus is, kan het verontreinigd zijn met bacterieel DNA, wat de chromatografiekolom kan verstoppen. Herhaal in dat geval de ultracentrifugatie om het bacteriële DNA neer te slaan.
5. Bereid 500 mL Buffer A (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM NaCl, 500 μM PMSF) en 500 mL Buffer B (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM NaCl, 500 μM PMSF, 200 mM imidazole) voor.
   OPMERKING: Houd in dit protocol het fast protein liquid chromatography (FPLC) systeem, alle buffers en het monster bij 4 °C in een koude kamer.
   1. Filter Buffers A en B steriel met wegwerpfiltereenheden van 0,2 μm. Afhankelijk van het FPLC-systeem wast u pomp A en pomp B respectievelijk met Buffer A en Buffer B. Laat 90% Buffer A en 10% Buffer B door het systeem stromen totdat de conductiviteits- en ultraviolet (UV)-metingen stabiliseren. De maximale stroomsnelheid is afhankelijk van het instrument; gebruik een stroomsnelheid van 5 mL/min met een maximale druklimiet van 1,0 MPa.
6. Bereid een FPLC-kolom van 110 mm lang en 5 mm diameter voor met 1,5 mL nikkel-geladen hars (maximale bindingscapaciteit 50 mg/mL, maximale druk 1 MPa). De kolom mag de dag vóór de zuivering worden voorbereid en bij 4 ˚C worden bewaard.
7. Sluit de kolom aan op het FPLC-instrument. Equilibreer de kolom met 20 mL van 90% Buffer A en 10% Buffer B (20 mM imidazole) bij een stroomsnelheid van 0,5 mL/min met een maximale druklimiet van 0,5 MPa. Het instrument moet real-time gegevens verzamelen van de conductiviteit en UV-absorbentie bij 280 nm (A₂₈₀). De conductiviteits- en UV-metingen moeten stabiliseren. Als deze metingen niet zijn gestabiliseerd, laat dan buffers door de kolom stromen totdat ze stabiel zijn.
8. Laad het eiwitmonster (~10 mL per pellet) op de kolom bij een stroomsnelheid van 0,15 mL/min met een maximale druklimiet van 0,5 MPa. De stroomsnelheid en kolomdruk blijven gedurende de gehele zuivering gelijk. Verzamel de flow-through in een buis van 50 mL.
   1. Was de kolom met 20 mL 90% Buffer A en 10% Buffer B. Verzamel de wasvloeistof in een buis van 50 mL. Elueer de eiwitten met een lineaire gradiënt van 20 mL van 10% tot 100% Buffer B (20 mM tot 200 mM imidazole).
   2. Was de kolom tot slot met 5 mL 100% Buffer B (200 mM imidazole). Verzamel de gradiënt en de laatste wasstap in fracties van 0,27 mL.
9. Meng 15 μL van 2x SDS-PAGE monsterbuffer met 15 μL van de flow-through-, was- en piek A₂₈₀-fracties. Kook de monsters gedurende 3 min.
   1. Bereid twee 10% SDS-PAGE gels voor. Laad 10 μL van elk monster op de gels en 4 μL voorgekleurde eiwitstandaarden. Run, kleur en analyseer de gels.
   2. Combineer de fracties die op basis van visuele inspectie bijna zuiver prototype foamy virus integrase (PFV IN) lijken te bevatten. Meet het volume door te pipetteren, doorgaans 8 - 10 mL.
   3. Meet met een spectrofotometer de A₂₈₀ van de gecombineerde fracties en bereken de totale hoeveelheid PFV IN-eiwit; de typische opbrengst is ~10 mg per liter geïnduceerde cultuur. De extinctiecoëfficiënt van PFV IN met de hexahistidine-tag is 59360 cm^-1 M^-1.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
BL21/DE3 Rosetta E. coli	EMD Millipore	70956-4
Imidazool	Sigma-Aldrich	I0250
Ni-NTA Superflow	Qiagen	30430