Zuivering van virale integrase met behulp van heparine-affiniteitschromatografie

Samenvatting

Bron: Lopez Jr., M. et al. Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase. J. Vis. Exp. (2017)

Deze video demonstreert de procedure voor het zuiveren van viraal integrase van bacteriële nucleasecontaminatie met behulp van heparin Sepharose-kolomchromatografie, gevolgd door SDS-PAGE-analyse om de eiwitzuiverheid te bevestigen.

Protocol

1. Heparine-affiniteitschromatografie
   1. Bereid 250 mL Buffer C (50 mM tris(hydroxymethyl)aminomethaanhydrochloride (Tris-HCl), pH 7.5, 10 mM dithiothreïtol (DTT), 0.1 mM ethylendiaminetetraazijnzuur (EDTA), 500 μM fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF)) en 250 mL Buffer D (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 500 μM PMSF, 1 M NaCl) voor.
      OPMERKING: In dit protocol worden het fast protein liquid chromatography (FPLC)-systeem, de buffers en het monster bewaard in een koelruimte bij 4 ˚C.
      1. Filter Buffer C en D steriel met wegwerppiltereenheden van 0.2 μm. Afhankelijk van het FPLC-systeem worden pomp A en pomp B respectievelijk gewassen met Buffer C en Buffer D. Laat 80% Buffer C en 20% Buffer D door het systeem stromen totdat de geleidbaarheid en de ultraviolet (UV)-metingen stabiliseren. De maximale stroomsnelheid is afhankelijk van het instrument; wij gebruiken gewoonlijk een stroomsnelheid van 5 mL/min met een maximale druklimiet van 1.0 MPa.
   2. Bereid een FPLC-kolom van 80 mm lang en 5 mm diameter voor met 1 mL heparine Sepharose-hars (maximale bindingscapaciteit 2.0 mg runderantithrombine III per mL hars; maximale druk 1.4 MPa). De kolom kan de dag vóór de zuivering worden voorbereid en bij 4 °C worden bewaard. Sluit de kolom aan op het FPLC-instrument.
      1. Equilibreer de kolom met 20 mL van 80% Buffer C en 20% Buffer D (200 mM NaCl) bij een stroomsnelheid van 0.5 mL/min met een maximale druklimiet van 1 MPa. Het instrument moet real-time gegevens verzamelen over de geleidbaarheid en de UV-absorptie bij 280 nm (A₂₈₀). De geleidbaarheids- en UV-metingen moeten stabiliseren. Als deze metingen niet zijn gestabiliseerd, laat de buffers dan verder door de kolom stromen totdat ze stabiel zijn.
   3. Verlaag de NaCl-concentratie van het prototype foamy virus integrase (PFV IN)-monster tot 200 mM door 1.5 volumes Buffer C toe te voegen. Voeg bijvoorbeeld 15 mL Buffer C toe aan 10 mL PFV IN. Ons totale volume is doorgaans ~25 mL.
   4. Laad het verdunde PFV IN-monster op de heparine Sepharose-kolom bij een stroomsnelheid van 0.5 mL/min met een maximale druklimiet van 1.0 MPa. De stroomsnelheid en de kolomdruk blijven gedurende de gehele zuivering gelijk. Verzamel de flow-through in een conische buis van 50 mL.
      1. Was de kolom met 20 mL van 80% Buffer C en 20% Buffer D (200 mM NaCl) en verzamel het wassel in een conische buis van 50 mL. Elueer de kolom met een lineaire gradiënt van 30 mL van 20% tot 100% Buffer D (200 mM tot 1 M NaCl).
      2. Was de kolom met 5 mL 100% Buffer D. Verzamel de gradiënt en het laatste wassel in fracties van 0.37 mL.
   5. Analyseer het geladen monster, de flow-through, het wassel en de fracties via 8% natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE). PFV IN heeft, na afsplitsing van de hexahistidine-tag, een molecuulgewicht van 44,394 Da, en de extinctiecoëfficiënt blijft 59,360 cm^-1 M^-1 zonder de hexahistidine-tag. Bewaar alle fracties bij 4 ˚C tot de voltooiing van een nuclease-assay.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)	Denville Scientific	CI8280
Tris Ultra Pure	Gojira Fine Chemicals	UTS1003
NaCl	P212121	RP-S23020
PMSF (Phenylmethanesulfonylfluoride)	Amresco	754
DTT (Dithiothreitol)	P212121	SV-DTT
UltraPure EDTA	Invitrogen/Gibco	15575
Heparin Sepharose 6 Fast Flow	GE Healthcare Life Sciences	17-0998-01