In deze video wordt de plaque-assay voor virussen beschreven met behulp van pseudoviruspartikels van het coronavirus. Het verdunde pseudovirus wordt toegevoegd aan een monolaag van zoogdiercellen, gevolgd door incubatie met een methylcellulose-overlay. Plaques gevormd door geïnfecteerde cellen worden visueel geteld om de infectieuze virustiter te bepalen.
Methodenartikel
Kwantificering van pseudovirusdeeltjes via plaque-assay
22 weergaven
⸱
30 september 2026
In dit artikel
Samenvatting
Protocol
Titering van het pseudovirus van het vesicular stomatitis virus dat het coronavirus spike-eiwit en enhanced green fluorescent protein (VSV-S-eGFP) tot expressie brengt
1. Seriële verdunning om de virale titer te bepalen
1. Zaai Vero E6-cellen uit op 6-wells platen met een zaaidichtheid van 6 × 105 cellen per well in Dulbecco's Modified Eagle Medium of DMEM (met 10% FBS (foetaal runderserum)) en incubeer deze overnight bij 37 °C met 5% CO₂.
OPMERKING: Vero-cellen die TMPRSS2 en hACE2 overexpresseren, kunnen ook worden gebruikt.
2. Maak een 10-voudige seriële verdunningsreeks van het VSV-SeGFP-virus in koud serumvrij DMEM door 900 μL medium in zeven microcentrifugebuisjes aan te brengen. Label de buisjes van 1 tot 7. Voeg 100 μL van de virale stock toe aan het eerste buisje en vortex kort. Overbreng 100 μL van het verdunde virus van buisje 1 naar buisje 2 en vortex kort; herhaal dit tot en met buisje 7.
3. Aspireer het medium uit alle wells van de 6-wells plaat met Vero E6-cellen en vervang dit door 500 μL van de verdunningen 105 tot 107. Incubeer de platen gedurende 45 min bij 37 °C met 5% CO₂, waarbij elke 15 min voorzichtig wordt geschud.
4. Aspireer het inoculum en vervang dit door een overlay bestaande uit een 1:1 mengsel van 2x DMEM en 6% carboxymethylcellulose (CMC), met een eindconcentratie van 3% CMC, aangevuld met 10% FBS; incubeer gedurende 48 u bij 34 °C met 5% CO₂.
OPMERKING: Warm het overlay-mengsel tijdens de infectiestap 15 min voor in een waterbad van 37 °C. Een 1:1 mengsel van 1% agarose met 2x DMEM aangevuld met 10% FBS kan in plaats van CMC worden gebruikt. Om met agarose te overleggen, kook 1% agarose (in dH₂O) en meng dit met koud 2x DMEM. Zorg dat het mengsel een geschikte temperatuur heeft voordat het aan de cellaag wordt toegevoegd (ongeveer 37-40 °C). Als agarose voor de overlay wordt gebruikt, moeten de cellen worden gefixeerd door incubatie in 2 mL van 3:1 methanol:azijnzuur gedurende ten minste één uur voorafgaand aan de kleuring.
2. Kleuring en berekening van de virustiter
1. Visualise plaques door kleuring met kristalviolet of door directe visualisatie van eGFP onder een fluorescentiemicroscoop.
2. Om de platen te kleuren, aspireer de overlay, was één keer met PBS en voeg vervolgens 2 mL 0,1% kristalviolet (in 80% methanol en dH₂O) toe aan elke well. Plaats de platen gedurende ongeveer 20 min bij kamertemperatuur op een plaatschudder voordat de kleur wordt verwijderd. Verwijder het kristalviolet en was elke well voorzichtig twee keer met dH₂O of PBS.
OPMERKING: De was- en kleuringsstappen moeten voorzichtig worden uitgevoerd door langzaam tegen de wand van elke well te pipetteren, om ervoor te zorgen dat de cellaag gedurende de gehele procedure intact blijft.
3. Laat de platen ten minste 1 u drogen voordat de plaques worden geteld. Zorg ervoor dat de plaque-tellingen worden verkregen uit wells die 20 tot 200 plaques bevatten. Om de titer van het virus in plaque-vormende eenheden (PFU) per mL te berekenen, vermenigvuldigt u de verdunningsfactor van de getelde well met het infectievolume en deelt u het aantal plaques in de betreffende well door dit getal.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0,25% trypsine-EDTA (Gibco) | Fisher scientific | LS25200114 | |
| Vero E6-cellen | ATCC | CRL-1586 | |
| carboxymethylcellulose | Sigma | C5678 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (Gibco) | Fisher scientific | 10-013-CV | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (poeder) (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 12-800-017 | |
| Dulbecco’s fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) | Fisher scientific | 21-031-CV | |
| Penicilline/streptomycine | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike neutraliserend antilichaam, muis Mab | SinoBiological | 40592-MM57 |
