Antilichaam-gemedieerde neutralisatie van pseudovirussen die het coronavirus-spike-eiwit tot expressie brengen met behulp van patiëntenserum

Samenvatting

Bron: Jamieson, T. R., et al. Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection. J. Vis. Exp. (2021)

Deze video demonstreert de antilichaam-gemedieerde neutralisatie van pseudovirussen die coronavirus-spike-eiwitten dragen met gebruik van patiëntenserum, bestudeerd via high-throughput fluorescentie-imaging van geïnfecteerde epitheelcelmonolagen.

Protocol

Alle procedures met betrekking tot de monstername zijn uitgevoerd in overeenstemming met de IRB-richtlijnen van het instituut.

1. Antilichaam- of serumverdunningen en infecties

OPMERKING: Dit protocol kan worden toegepast om de neutralisatie van het pseudovirus van het vesicular stomatitis virus dat het spike-eiwit van het coronavirus en enhanced green fluorescent protein tot expressie brengt (VSV-S-eGFP) te meten met behulp van zowel commercieel verkrijgbare antilichamen als patiëntenserum, alsmede serum verzameld van dieren voor preklinische studies naar vaccinontwikkeling.

1. Seriële verdunningsreeks
   1. Heat-inactiveer vóór het verdunnen van de serummonsters elk monster gedurende 30 min in een waterbad van 56 °C om het complement te inactiveren. Neem de nodige veiligheidsvoorzorgsmaatregelen bij het hanteren van patiëntenmonsters; open monstercontainers alleen in de weefselkweekkap en zorg dat persoonlijke beschermingsmiddelen voor inperkingsniveau 2 worden gedragen.
   2. Stel de verdunningsreeks op in een lege 96-wells plaat (Plaat 1).
   3. Start alle verdunningen in rij A van de 96-wells plaat in 80 µL. *Voor patiëntenmonsters begint de verdunningsreeks bij 1 op 10 door 8 µL serum te voegen aan 72 µL serumvrij Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) (met 1% penicilline/streptomycine).
      OPMERKING: De gebruikte concentratie neutraliserende antilichamen is afhankelijk van de door de fabrikant voorspelde activiteit. Voor het hier gebruikte SARS-CoV-2 Spike-neutraliserende antilichaam (zie de Tabel met materialen), begin met 5 µg/mL om ten minste 50% neutralisatie waar te nemen.
   4. Voeg 40 µL serumvrij DMEM (met 1% penicilline/streptomycine) toe aan de rijen B tot G, en 80 µL aan rij H. Voeg geen virus toe aan rij H, aangezien dit dient als controle met alleen cellen.
   5. Meng en overbreng met een 12-kanaals pipette 40 µL verdund serum of antilichaam van rij A naar rij B. Meng en herhaal dit tot rij F, en verwijder vervolgens 40 µL uit rij F. Voeg geen serum toe aan rij G, aangezien dit de controlerij met alleen virus is.
2. Infectie en overlay
   1. Bereid een geschikt volume verdund VSV-S-eGFP voor om elke well te behandelen met een multiplicity of infection (MOI) van 0,05 (of 2000 plaque-forming units (pfu)). (Houd bij deze berekening rekening met het feit dat slechts 60 µL van het totale volume van 80 µL op de cellen wordt overgebracht; vermenigvuldig daarom het volume van het virus met 1,33 om 2000 pfu te behouden).
      OPMERKING: Omdat VSV-S-eGFP temperatuurgevoelig is, moet u ervoor zorgen dat virusvoorraden op ijs blijven wanneer ze niet worden gebruikt, en vermijd meerdere vries-dooi-cycli omdat titers zullen variëren na herhaaldelijk vriezen.
   2. Voeg 40 µL verdund virus toe aan elke well in de rijen A tot G van Plaat 1 en meng door 4-5 keer op en neer te pipetteren. Incubeer de plaat gedurende 1 h bij 37 °C met 5% CO₂.
   3. Haal de plaat met cellen uit de incubator (Plaat 2) en aspireer voorzichtig het medium uit alle wells. Breng 60 µL van het antilichaam/virusmengsel over van Plaat 1 naar Plaat 2 en incubeer gedurende 1 h bij 37 °C met 5% CO₂, waarbij de plaat elke 20 min wordt geschud.
   4. Vul elke well aan met 140 µL overlay bestaande uit carboxymethylcellulose (CMC) in DMEM voor een eindconcentratie van 3% CMC (met 10% FBS (foetaal runderserum) en 1% penicilline/streptomycine). Plaats Plaat 2 in een incubator ingesteld op 34 °C met 5% CO₂ gedurende ongeveer 24 h vóór de beeldvorming.
      OPMERKING: Verwarm het overlaymengsel tijdens de infectiestap 15 min voor in een waterbad van 37 °C.

2. Beeldvorming en kwantificering (Dag 3)

1. Beeld de platen af met een geautomatiseerde fluorescentie-imager (met gebruik van een fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-filter of een alternatief filter met een excitatiegolflengte van 488 nm). Kwantificeer de virale infectie door een protocol op te stellen dat individuele eGFP (enhanced green fluorescent protein)-foci automatisch identificeert en telt. Als er geen automatische tel functie beschikbaar is, gebruik dan ImageJ-software om het aantal eGFP-foci te kwantificeren.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Carboxymethylcellulose	Sigma	C5678
Dulbecco's modified Eagle's medium (Gibco)	Fisher scientific	10-013-CV
Dulbecco's modified Eagle's medium (Poeder) (Gibco)	Thermo Fisher Scientific	12-800-017
Vero E6-cellen	ATCC	CRL-1586
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS)	Fisher scientific	21-031-CV