Monitoring van stadiumspecifieke genexpressie in het vacciniavirus met behulp van fluorescente reporters

Samenvatting

Bron: Rozelle, D. K., et al. Vaccinia Reporter Viruses for Quantifying Viral Function at All Stages of Gene Expression. J. Vis. Exp. (2014)

Deze video demonstreert een methode om de replicatie van het vacciniavirus te monitoren met behulp van fluorescente reporters die gereguleerd worden door fase-specifieke promotors. Sequentiële expressie van groene, rode en blauwe fluorescente eiwitten markeert de vroege, intermediaire en late fasen van de infectie, wat high-throughput analyse van fase-specifieke virale genexpressie mogelijk maakt.

Protocol

1. Platen van cellen

1. Los HeLa-cellen van de plaat en verdun ze in groeimedium (Dulbecco's Modified Eagle Medium [DMEM], 2 mM L-glut, 10% foetaal runderserum [FBS]) tot ongeveer 2.0 x 10⁵ cellen/ml. Verdeel 100 μl/well in een 96-well plaat met zwarte wanden en een doorzichtige, vlakke bodem (20.000 cellen/well).
2. Incubeer de cellen gedurende 24 uur tot ze confluent zijn in een incubator bij 37 °C + 5% CO₂.

2. Infecteer cellen

1. Verdun de virussen en infecteer de cellen.
   1. Ontdooi het fluorescerende virus TrpV (Triple virus; Early Venus, Intermediate mCherry, Late TagBFP) en PLV (Promoter-less Venus) en aggregeer deze door 5 minuten lang sonicatie toe te passen. Alternatief kunnen ruwe virusvoorraden in een verhouding van 1:1 worden gemengd met 0,25 mg/ml trypsine in infectiemedium en 30 min lang worden geïncubeerd bij 37 °C.
   2. Verdun de ruwe virusvoorraden in infectiemedium bij 37 °C (DMEM, 2 mM L-glut, 2% FBS). Voor infecties met een hoge MOI (10 PFU/cel) wordt de virusvoorraad verdund tot 1,0 x 10⁷ PFU/ml, uitgaande van 5 x 10⁴ cellen/well en een inoculumvolume van 50 μl. Plan de infectie van 3 replica-wells per behandeling met TrpV en nog eens 3 replica-wells voor dezelfde behandeling met PLV om rekening te houden met de achtergrondfluorescentie die specifiek is voor elke behandeling.
   3. Infecteer de wells door 50 μl/well verdund virus in infectiemedium toe te voegen. Dit wordt gedefinieerd als tijd = 0 uur na infectie (0 hpi).
2. Incubeer 6-24 uur in een incubator bij 37 °C + 5% CO₂.

3. Fixeer cellen

1. Fixeer de cellen door 100 μl 8% paraformaldehyde toe te voegen aan het infectiemedium dat zich al in elke well bevindt. Incubeer gedurende 15 min bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht.
   OPMERKING: Het wordt aanbevolen om 2x Paraformaldehyde (8%) rechtstreeks aan het infectiemedium toe te voegen om aerosolisatie van infectieuze vaccinia te voorkomen, wat kan gebeuren als medium met een hoog titer direct in de afvalbak wordt omgegoten vóór de fixatie.
2. Verwijder het fixatief door de plaat om te keren boven de afvalbak.
3. Voeg 100 μl fosfaatgebufferde zoutoplossing op kamertemperatuur toe.
4. Sluit de plaat af met een optisch transparante klevende folie.
   OPMERKING: Platen kunnen bij 4 °C worden bewaard als ze niet onmiddellijk worden uitgelezen. Zorg ervoor dat afgesloten platen terugkeren naar kamertemperatuur vóór het uitlezen om te voorkomen dat condensatie de spectrophotometer-metingen verstoort.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11995-065
Fetaal runderserum - Optima, hitte-inactivering (FBS)	Atlanta Biologicals	S12450H
200 mM L-glutamine, (L-glut)	Gibco	25030-081
96-wells microplates, vlakke transparante bodem, zwart polystyreen, TC-behandeld	Corning	3603
Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS)	Gibco	10010-023
TempPlate RT optisch transparante film	USA Scientific	2978-2700
Opti-MEM Reduced Serum Medium	Gibco	31985-070