Isolatie en zuivering van virussen uit geïnfecteerde insectenlichamen

Samenvatting

Bron: Biesbrock, A. M. et al. Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture. J. Vis. Exp. (2014)

Deze video demonstreert de in vitro propagatie van Homalodisca coagulata Virus-01 met behulp van gastcellen afgeleid van insecten. Er wordt ingegaan op de stappen voor viruszuivering, inoculatie en replicatie binnen gekweekte insectencellen.

Protocol

1. Extractie van het volledige virus

1. Homogeniseer volledige lichamen van virus-positieve H. vitripennis in fosfaatbuffer, pH ~7,2, met 0,02% natriumdiethyldithiocarbamaattrihydraat (DETCA) door te vortexen in intervallen van ~10 sec totdat er geen grote weefselklonten meer aanwezig zijn. Extraheer het virus via supersnel centrifugeren bij 124.500 x g gedurende 4 hr bij 4 °C of 22.000 x g gedurende 16 hr bij 4 °C. Als er aan de bovenzijde een neerslag ontstaat, verwijder deze dan met een steriel wattenstaafje.
2. Gooi het supernatant weg.
3. Verzamel het pellet en los dit op in 5 ml 10 mM fosfaatbuffer (zonder DETCA), pH ~7,2, bevattende 0,4% Na-deoxycholzuur en 4% polyethyleenglycolhexadecylether (Brij 52).
   1. Om het pellet goed te mengen, kan het pellet indien nodig van de wand van de buis worden verwijderd en fijngecrushed totdat het is opgelost.
   2. Voeg indien nodig extra 10 mM fosfaatbuffer toe in stappen van ~5 ml om het pellet te helpen oplossen, en verdeel dit over 2 buizen.
4. Centrifugeer de oplossing bij 300 x g gedurende 15 min.
5. Verwijder het supernatant en leid de oplossing door een 0,45 μm filter, en verzamel het filtraat in een grote opvangbuis.
6. Overbreng het filtraat naar een dialysemembraan met een molecular weight cut off (MWCO) van 3,5 kD, waarbij indien nodig kleine hoeveelheden 10 mM fosfaatbuffer (pH 7) zonder DETCA worden gebruikt.
7. Plaats het dialysemembraan in een groot bekerglas gevuld met ddH₂O bij 4 °C. Vervang de ddH₂O elk uur gedurende 5 - 6 hr, totdat er een witte neerslag in het membraan ontstaat.
8. Verzamel het gezuiverde virus uit het membraan en onderwerp de 100% virusoplossing aan een 10-voudige verdunningsreeks door 10 μl oplossing toe te voegen aan 90 μl ddH₂O. Voeg vervolgens 10 μl van de verdunning toe aan nog eens 90 μl ddH₂O totdat een verdunning van 1:100.000 is bereikt.
9. Bewaar de virusoplossing bij -80 °C.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Corning cell culture flasks	Sigma Aldrich	CLS430168	Oppervlakte 25 cm², schuine hals, dop (stopafdichting)
Olympus DP30BW, IX2-SP, IX71	Olympus		Omgekeerde microscoop en camera
Greiner CELLSTAR multiwell culture plates	Sigma Aldrich	M8937	48 wells (TC-behandeld met deksel)
DETCA	Sigma Aldrich	228680	Natriumdiethyldithiocarbamaat-trihydraat
Corning bottle-top vacuum filter system	Sigma Aldrich	CLS431206	Celluloseacetaatmembraan, poriegrootte 0.45 μm, membraanoppervlak 54.5 cm², filtercapaciteit 500 ml
Brij 52	Sigma Aldrich	388831	Polyethyleenglycol-hexadecylether
Phosphate buffer solution	Sigma Aldrich	P5244	Ontvangen als 100 mM, verdund tot 10 mM met steriel water
PBS	Sigma Aldrich	P5368	Fosfaatgebufferde zoutoplossing
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A2153
Grace’s Insect medium (supplemented, 1x)	Sigma Aldrich	G8142	Component van H2G+ cicada-medium
L-histidine monohydrate	Sigma Aldrich	H8125	Component van H2G+ cicada-medium
Medium 199 (10x)	Sigma Aldrich	M4530	Component van H2G+ cicada-medium
Medium 1066 (1x)	Sigma Aldrich	C0422	Component van H2G+ cicada-medium
Hank’s Balanced Salts (1x)	Sigma Aldrich	51322C	Component van H2G+ cicada-medium
L-Glutamine (100x)	Sigma Aldrich	G3126	Component van H2G+ cicada-medium
MEM, amino acid mix (50x)	Sigma Aldrich	56419C	Component van H2G+ cicada-medium
1 M MgCl solution	Sigma Aldrich	M8266	Component van H2G+ cicada-medium
Pen-Strep	Sigma Aldrich	G6784	Component van H2G+ cicada-medium
Nystatin	Sigma Aldrich	N6261	Component van H2G+ cicada-medium
Gentamycin	Sigma Aldrich	46305	Component van H2G+ cicada-medium
Dextrose	Sigma Aldrich	D9434	Component van H2G+ cicada-medium
Fetal Bovine Serum	Sigma Aldrich	F2442	Component van H2G+ cicada-medium