Generatie van recombinant lentivirus in zoogdiercellen

In dit artikel

Samenvatting

Bron: Zhang, Y., et al., Direct Reprogramming of Mouse Fibroblasts into Melanocytes. J. Vis. Exp. (2021)

Deze video demonstreert de productie en concentratie van recombinant lentivirus in zoogdiercellen, wat een efficiënte genoverdracht van transcriptiefactoren of andere genetische elementen mogelijk maakt voor toepassingen zoals cellulaire herprogrammering, functionele studies en potentieel therapeutisch onderzoek.

Protocol

1. Constructie van een geconcentreerd lentivirus-packagingsysteem voor transcriptiefactoren

Productie van het geconcentreerde virus (Figuur 1A, B)
1. Zaai 1,5 × 10⁶ HEK (human embryonic kidney)-293T-cellen uit in een schaal van 60 mm en kweek deze cellen in normaal medium (zie Tabel 1) bij 37 °C in een bevochtigde incubator met 5% CO₂.
  OPMERKING: Als het virus in batches moet worden verpakt, kan een celkweekschaal van 100 mm worden gebruikt (voor details, zie Tabel 2).
2. Controleer na 24 u op de dag van transductie of de HEK-293T-cellen een confluentie van 80-90% hebben bereikt en vervang het medium door 3,5 mL DMEM (Dulbecco’s modified eagle medium) (150 µL DMEM per 1 cm²). Laat de cellen 2 u bij 37 °C in een bevochtigde incubator met 5% CO₂ staan.
  OPMERKING: Het vervangingsmedium moet serumvrij zijn, zodat de cellen kunnen worden "uitgehongerd" voor een betere plasmidtransfectie.
3. Bereid het mengsel van plasmiden (mix A) voor, bestaande uit 3 µg van de doelplasmiden van Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 of Snai2; 1 µg van het verpakkingsplasmid PMD2.G en 2 µg van het verpakkingsplasmid PSPAX2. Vul het volume van mix A aan tot 150 µL met serumvrij DMEM. Bereid het mengsel van het transfectiereagens (mix B) voor door 12 µL van het transfectiereagens toe te voegen (het volume is twee keer de totale massa van alle plasmiden) en vul het volume van mix B aan tot 150 µL met serumvrij DMEM.
  OPMERKING: Bij het bereiden van de mengsels is het belangrijk om de vloeistof langzaam toe te voegen om luchtbellen te voorkomen.
4. Combineer mix A en mix B nadat deze 5 min op kamertemperatuur hebben gestaan. Incubeer het mengsel 20-30 min op kamertemperatuur om het transfectiecomplex te vormen.
5. Haal de HEK-293T-cellen uit de incubator, vervang het medium door DMEM + 2% FBS (fetal bovine serum), voeg het mengsel uit stap 1.1.4 druppelsgewijs toe en meng de vloeistof voorzichtig.
6. Vervang na 8 u het medium door 3,5 mL normaal medium. Verzamel na het vervangen van het medium het virussupernatans na 24 u en 48 u.
7. Meng de virussupernatansen die op twee verschillende tijdstippen zijn verzameld. Centrifugeer 5 min bij 200 × g bij 4 °C. Filtreer het supernatant door 0,45 µm filters en verzamel het in een steriele conische buis van 50 mL.
  OPMERKING: Het virus dat na 24 u is verzameld, kan worden bewaard bij 4 °C en gemengd worden met het virus dat na 48 u is verzameld.
8. Concentreer het virussupernatans door overnacht (~16 u) te centrifugeren bij 6000 × g bij 4 °C. Controleer of de viruspellet onderin de conische buis zichtbaar is na het centrifugeren.
9. Giet het supernatant langzaam af. Los de viruspellet op in een volume normaal medium dat 1/100^e deel is van het volume van het virussupernatans. Pipetteer met een P1000-micropipet voorzichtig op en neer totdat een homogeen mengsel is verkregen. Verdeel het geconcentreerde virus naar behoefte in microcentrifugebuisjes. Bewaar bij −80 °C.
  OPMERKING: Met deze methode wordt het virus 100x geconcentreerd. Het geconcentreerde virus (100x) kan >1 jaar worden bewaard bij −80 °C. Vermijd herhaaldelijk invriezen en ontdooien van het virus.

Tabel 1: Componenten van normale en herprogrammeringsmedia.

	Componenten	Dosis (concentratie, volume)	Eindconcentratie
Normaal medium (100 mL)	DMEM/HOGE GLUCOSE	89 mL
	Hitte-geïnactiveerd FBS	10 mL
	Antibiotica (Pen/Strep)	10000 U/mL, 1 mL	100 U/mL
Herprogrammeringsmedium (100 mL)	RPMI-1640	88 mL
	Hitte-inactieverdunnend FBS	10 mL
	Recombinant menselijk SCF	200 μg/mL, 50 μL	100 ng/mL
	Recombinant humaan bFGF	4 μg/mL, 250 μL	10 ng/mL
	Recombinant menselijke insuline	10 mg/mL, 50 μL	5 μg/mL
	menselijk EDN3	100 μM, 100 μL	0.1 μM
	choleratoxine	0,3 mg/mL, 0.56 μL	20 pM
	Phorbol-12-myristaat-13-acetaat (TPA)	1 mM, 20 μL	200 nM
	Hydrocortison	100 μg/mL, 500 μL	0.5 μg/mL
	Adenine	40 mg/mL, 60 μL	24 μg/mL

Tabel 2: Details van het lentivirus-verpakkingssysteem.

Kweekschaal	Zaaidichtheid (cellen/schaal)	Medium (mL)	Plasmidensysteem			Transfectiereagens (µL)
Kweekschaal	Zaaidichtheid (cellen/schaal)	Medium (mL)	Doelplasmide (μg)	PMD2.G (μg)	PSPAX2 (μg)	Transfectiereagens (µL)
35 mm	6 ×105	1.5	1.5	0.5	1	6
60 mm	1.5 × 106	3.5	3	1	2	12
100 mm	4 × 106	8	8	3	6	34

Resultaten

Figuur 1: Productie van geconcentreerd virus en schatting van de titer. (A) Fluorescentie-intensiteit van GFP (green fluorescence protein) na infectie van HEK-293T-cellen met niet-geconcentreerd lentivirus (1x) en geconcentreerd lentivirus (100x) (B) Vergelijking van de infectiegraden van niet-geconcentreerd lentivirus (1x) en geconcentreerd lentivirus (100x) zoals gedetecteerd door flowcytometrie. (C) Titerschatting van geconcentreerd lentivirus. Schaalbalken = 250 µm. Afkortingen: GFP = green fluorescent protein; TU = transducing units.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0,45 μM filter	Millipore	SLHVR33RB
95%/100% ethanol	LANBAO	210106	Bewaard bij RT
Antibiotica (Pen/Strep)	Gibco	15140-122	Bewaard bij -20 °C
Anti-TRP2/DCT antilichaam	Abcam	ab74073	Gastheer/Isotype: Konijn IgG; Soortreactiviteit: Muis/Mens; Verdunning van 1:200 voor gebruik
DMEM (Hoge glucose)	HyClone	SH30243.01	Bewaard bij 4 °C
DMSO	Sigma	D2650	Bewaard bij RT
FBS	Gibco	10270-106	Bewaard bij -20 °C; hitte-geïnactiveerd voor gebruik
Gelatine	Sigma	G9391	Bewaard bij RT
GFP-PURO plasmiden (Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 en Snai2)	Hanheng Biological Technology Co., Ltd.	pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325	Bewaard bij -20 °C
Hematoxyline	Abcam	ab220365	Bewaard bij RT
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019	Transfectiereagens, bewaard bij 4 °C
PBS (-)	Gibco	C10010500BT	Bewaard bij RT
Phorbol 12-myristaat 13-acetaat (TPA)	Sigma	P8139	Voorraadconcentratie 1 mM; Eindconcentratie 200 nM
Polybrene	Sigma	H9268	Kationisch polymeer transfectiereagens; Voorraadconcentratie 8 μg/µL; Eindconcentratie 4 ng/µL
Puromycine	Gibco	A11138-03	Bewaard bij -20 °C
Recombinant humaan bFGF	Invitrogen	13256-029	Voorraadconcentratie 4 μg/mL; Eindconcentratie 10 ng/mL
Recombinant humane insuline	Sigma	I3536	Voorraadconcentratie 10 mg/mL; Eindconcentratie 5 µg/mL