Productie van transcriptie- en replicatie-competente virusachtige partikels van het Ebolavirus met een reportergen

Samenvatting

Bron: Hoenen, T., et al. Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes. J. Vis. Exp. (2014)

Deze video demonstreert hoe een tetracistronisch minigenoomplasmide dat het genoom van het Ebolavirus nabootst, samen met helperplasmiden in menselijke cellen wordt getransfecteerd. In de cellen worden virale eiwitten en luciferase tot expressie gebracht, wat leidt tot de assemblage en het uitstoten van niet-pathogene, replicatiecompetente virusachtige deeltjes.

Protocol

1. Transfectie van producentencellen voor de initiële productie van transcriptie- en replicatie-competente virusachtige deeltjes of trVLPs

1. Pipette 24 uur na het splitsen van de cellen (zie Figuur 1 voor een overzicht van de timing van het experiment) plasmid-DNA (zie Tabel 1 voor de hoeveelheden) met gefilterde tips in een steriel cryovial van 2 mL. Voeg 100 µL OptiMEM per well toe aan het DNA. Vortex het mengsel kort en centrifugeer de buisjes voorzichtig met een microcentrifuge. Indien meerdere wells met identieke plasmiden moeten worden getransfecteerd, kan een mastermix voor meerdere wells worden gemaakt.
2. Vortex het vial met Transit LT1 kort voor gebruik. Voeg 7,5 µL Transit LT1 per well toe aan het verdunde DNA. Vortex het mengsel voorzichtig, waarbij u erop let dat er geen vloeistof in de dop van het cryovial terechtkomt, en incubeer dit gedurende 15 min bij kamertemperatuur.
3. Meng het transfectiecomplex voorzichtig door meerdere malen op te zuigen en uit te pipetteren. Voeg 100 µL van de transfectiecomplexen druppelsgewijs toe aan elke well. Beweeg de plaat voor/achter en van zij naar zij om de transfectiecomplexen te verspreiden. Draai de plaat niet rond, omdat dit zal leiden tot een ongelijkmatige verspreiding van de transfectiecomplexen.
4. Plaats de cellen terug in de incubator.
5. Verwijder na 24 uur het supernatant van de cellen. Voeg 4 mL DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) met 5% FBS (Fetal Bovine Serum), 2 mM L-glutamine, 1x pen/strep (penicilline/streptomycine) (DMEM5) toe aan de cellen. Deze stap kan voor maximaal 3 wells tegelijk worden uitgevoerd zonder dat de wells uitdrogen, mits de wells identieke monsters bevatten (anders kan, vanwege de zelf-amplificerende aard van de trVLPs (Transcription- and Replication-Competent Virus-Like Particles) in dit systeem, kruiscontaminatie een probleem worden, en moet deze stap per individuele well worden uitgevoerd).
6. Plaats de cellen terug in de incubator.

Tabel 1. DNA-hoeveelheden voor transfectie. De hoeveelheid van elk plasmide die nodig is voor de transfectie van producer- en targetcellen is weergegeven in ng per well van een 6-wells plaat.

	Producellen (p0)	Doelcellen (p1 en hoger)
pCAGGS-NP	125	125
pCAGGS-VP35	125	125
pCAGGS-VP30	75	75
pCAGGS-L	1,000	1,000
p4cis-vRNA-RLuc	250	-
pCAGGS-T7	250	-
pCAGGS-Tim1	-	250

Resultaten

Figuur 1. Tijdsverloop van een tetracistronische trVLP-assay voor 3 opeenvolgende passages. De dagen voor het uitzetten van cellen (s), transfecteren van cellen (t), infecteren van cellen (i), mediumverversing (c) en het oogsten van cellen en trVLPs (h) zijn aangegeven voor drie opeenvolgende passages (aangegeven met pijlen).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
75 cm² celkweekfles	Corning	430641
DMEM	Sigma	D6546	Voor gebruik voorverwarmen tot 37°C
FBS	Life technologies	26140-079	Hitte-inactiveren gedurende 30 min @ 56°C
L-Glutamine	Life Technologies	25030-081	100x
Pen/strep	Life Technologies	15070-063	100x
6-wells platen	Costar	3516
Opti-MEM I	Life Technologies	31985-070
Transit LT1	Mirus	MIR 2300