Op luciferase gebaseerde assay voor de evaluatie van antivirale verbindingen in humane embryonale niercellen

Samenvatting

Bron: Lucas-Hourani, M. et.al., High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses. J. Vis. Exp. (2014)

Deze video toont een op luciferase gebaseerde antivirale assay in menselijke embryonale niercellen die zijn geïnfecteerd met recombinant mazelenvirus. Het laat zien dat serieel verdunde testverbindingen de virale replicatie remmen, wat leidt tot een lagere luminescentie op een dosisafhankelijke wijze, terwijl de levensvatbaarheid van de gastheercel behouden blijft.

Protocol

1. Voorbereiding van celculturen geïnfecteerd met het mazelenvirus (MV) dat vuurvlieg-luciferase tot expressie brengt (rMV2/Luc)

1. Kweek HEK-293T-cellen bij 37 °C en 5% CO₂ in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) met gestabiliseerde L-glutamine en aangevuld met 10% foetaal kalfserum (FCS), streptomycine (100 μg/ml) en penicilline (100 IU/ml). De cellen worden elke 4-5 dagen gepasseerd door trypsinisatie en 1:10 verdund in een nieuwe kolf. Voor experimenten moeten de cellen zich in de logaritmische fase bevinden.
2. Oogst op de dag van het experiment de cellen door trypsinisatie en voer een cel telling uit. Pelleteer de cellen door centrifugatie en resuspendeer ze in kweekmedium op 3 x 10⁵ cellen/ml. Houd er rekening mee dat er 12,5 ml cel-suspensie nodig is voor elke screeningplaat.
3. Resuspendeer de cellen opnieuw op 3 x 10⁵ cellen/ml in kweekmedium. Houd er rekening mee dat er 12,5 ml cel-suspensie nodig is voor elke screeningplaat.
4. Optioneel: vul het kweekmedium aan met uridine in een concentratie van 20 μg/ml.
   OPMERKING: Bij het screenen van chemische bibliotheken naar remmers van virale replicatie blijkt dat verbindingen die zich richten op vroege stappen in de pyrimidinesynthese-route vaak worden geïsoleerd. De toevoeging van uridine aan het kweekmedium wordt gebruikt om dergelijke antivirale moleculen eruit te filteren. Dit herstelt namelijk efficiënt de virale replicatie wanneer stroomopwaartse enzymen van de pyrimidinesynthese-route worden geblokkeerd.
5. Bewaar 1:10 van de cel-suspensie voor controleputjes met niet-geïnfecteerde cellen en ga verder met de infectie van het resterende volume.
6. Ontdooi het juiste volume van de rMV2/Luc-stamoplossing. MV-stamoplossingen hebben gewoonlijk een concentratie van 10⁶-10⁸ infectieuze deeltjes per ml. De cultuur moet worden geïnfecteerd met 0,1 infectieuze deeltjes rMV2/Luc per doelcel, wat overeenkomt met een multiplicity of infection (MOI) van 0,1. 
   OPMERKING: rMV2/Luc is afgeleid van het MV-vaccin (Schwarz-stam) en wordt gehanteerd in een BSL2-omgeving.
7. Voeg het virus toe aan de cel-suspensie en meng voorzichtig. Breng de geïnfecteerde cellen over naar een reservoir en doseer 100 μl van de geïnfecteerde cel-suspensie in kolommen 2 tot en met 11 van D2-platen die chemische verbindingen bevatten. De cel-suspensie in het reservoir wordt regelmatig voorzichtig gemengd.
8. Doseer in kolommen 1 en 12 100 μl niet-geïnfecteerde cellen in elk putje. Geïnfecteerde cellen worden in de overige putjes gedoseerd.
9. Incubeer de cellen gedurende 24 uur bij 37 °C en 5% CO₂.

2. Secundaire screening op toxiciteit en breedspectrum antivirale activiteit

1. Maak 1:2 seriële verdunningen voor elke hit-verbinding in dimethylsulfoxide (DMSO), beginnend van 500 µM tot 4 µM (8 verdunningen). Vul witte, gestreepte weefselkweekplaten met 50 µl kweekmedium. Voeg 1 µl van elke verbindingsverdunning toe aan de kweekputjes. Herhaal dit tweemaal om 3 kweekplaten te verkrijgen met dubbele seriële verdunningen voor elke hit-verbinding.
2. Prepareer 37,5 ml van een HEK-293T cel-suspensie met 6 x 10⁵ cellen/ml in kweekmedium zoals hierboven beschreven (in 1.1 en 1.2). Verdeel 2x 12,5 ml in Falcon-buisjes en infecteer de cellen met ofwel rMV2/Luc bij MOI = 0,1 of recombinant chikungunya-virus (CHIKV) dat Renilla-luciferase tot expressie brengt (CHIKV/Ren) bij MOI = 0,2. Meng door te inverteren.
   OPMERKING: CHIKV/Ren is afgeleid van een wild-type stam van CHIKV en moet daarom in een BSL3-omgeving worden gehanteerd. Platen kunnen van BSL3 naar BSL1 worden verplaatst zodra het Renilla-substraat aan de kweekputjes is toegevoegd (zie hieronder).
3. Verdeel 50 µl niet-geïnfecteerde, rMV2/Luc-geïnfecteerde of CHIKV/Ren-geïnfecteerde cellen over de kweekplaten die de seriële verdunningen van de hit-verbindingen bevatten. Incubeer 24 uur bij 37 °C.
4. Voeg 50 µl vuurvlieg-luciferase substraat toe om de vuurvlieg-luciferase activiteit in de rMV2/Luc-geïnfecteerde putjes te bepalen. Voeg 50 µl Renilla-luciferase substraat toe om de Renilla-luciferase activiteit in de CHIKV/Ren-geïnfecteerde putjes te bepalen. Voeg tot slot 50 µl van een op luciferase gebaseerd viabiliteitsassay-reagens toe aan de niet-geïnfecteerde cellen om de cellulaire viabiliteit te bepalen.
5. Zet de gegevens uit (Figuur 1) en bepaal de concentraties van de hit-verbindingen die de replicatie van MV en CHIKV met 50% remmen. Negereer verbindingen die enige toxiciteit vertonen in deze assay.

Resultaten

Figuur 1. Dosis-responsvariant van de antivirale activiteit en toxiciteit van verbindingen C864, C648 en C062. (A) HEK-293T-cellen werden geïnfecteerd met de rMV2/Luc-stam van MV die luciferase tot expressie brengt (MOI=0,1) en geïncubeerd met toenemende doses van C864, C648, C062 of alleen DMSO. Na 24 uur werd de luciferase-expressie bepaald. * geeft aan dat de waargenomen luciferase-remmingen statistisch significant waren voor alle drie de verbindingen (p-waarden < 0,05). (B) HEK-293T-cellen werden geïnfecteerd met de CHIKV/Ren-stam van CHIKV die Renilla-luciferase tot expressie brengt (MOI=0,2) en geïncubeerd met toenemende doses van C864, C648, C062 of alleen DMSO. Na 24 uur werd de Renilla-luciferase-expressie bepaald. * geeft statistisch significante remmingen aan voor alle drie de verbindingen (p-waarden < 0,05). (C) HEK-293T-cellen werden geïncubeerd met toenemende doses van C864, C648, C062 of alleen DMSO. Als controle voor toxiciteit werden de celculturen aangevuld met 2,5 μl van een 0,5% IGEPAL-oplossing. Na 24 uur werd het aantal levende cellen bepaald met behulp van de op luciferase gebaseerde viabiliteitsassay.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Freedom EVO platform	TECAN		Robotplatform
96-wells polystyreen celkweek-microplaten, wit	Greiner Bio One	655083
CellTiter-Glo luminescente celviabiliteitsassay	Promega	G7570	Op luciferase gebaseerde viabiliteitsassay
Bright-Glo luciferase assaysysteem	Promega	E2610	Reagens met vuurvlieg-luciferasesubstraat
Renilla-Glo luciferase assaysysteem	Promega	E2710	Reagens met Renilla-luciferasesubstraat
Britelite plus reportergen-assaysysteem	Perkin-Elmer	6016761	Reagens met vuurvlieg-luciferasesubstraat. Kan worden gebruikt als alternatief voor het Bright-Glo-reagens om luciferase-activiteit te bepalen.