Isolatie van een enkel reuzenvirus uit een gemengde virale populatie met behulp van amoeben

Samenvatting

Bron: Sahmi-Bounsiar, D. et al. Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation. J. Vis. Exp. (2019)

Deze video demonstreert single-cell micro-aspiratie om een enkele populatie reuzenvirussen te isoleren en uit te breiden vanuit een gemengde virale populatie, waarbij amoeben als gastheercellen worden gebruikt.

Protocol

1. Amoebakweek

1. Gebruik Vermamoeba vermiformis (stam CDC19) als celondersteuning.
2. Voeg 30 mL protease-pepton-gistextract-glucose-medium (PYG) toe (Tabel 1) en 3 mL van de amoeben bij een concentratie van 1 x 10⁶ cellen/ml in een 75 cm² celkweekfles.
3. Houd de cultuur op 28 °C.
4. Kwantificeer na 48 uur de amoeben met behulp van telkamers.
5. Om te spoelen, worden de cellen geoogst bij een concentratie van 1 x 10⁶ cellen/ml en pelletteer de amoeben door centrifugatie bij 720 x g gedurende 10 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in het passende volume uithongeringsmedium om 1 x 10⁶ cellen/ml (Tabel 1).

2. Eindpuntverdunning

1. Voer een seriële verdunning uit (10^-1 tot 10^-11) van het virale monster in uithongeringsmedium (Tabel 1).
2. Inoculeer 2 mL van 1 x 10⁶ Vermamoeba vermiformis in elke petrischaal met 100 µL van het mengselinoculum.
3. Plaats de Petrischalen in een afsluitbare plastic zak bij 30 °C.
4. Begin met het observeren van de petrischalen met een omgekeerde optische microscoop 6 uur na infectie en controleer de celmorfologie elke 4 tot 8 uur.
5. Zodra het cytopathisch effect, gekenmerkt door het afronden van de cellen, optreedt, kan het proces van single-cell micro-aspiratie worden gestart.

3. Micro-aspiratie van individuele cellen

1. Bereid de gastheer voor
   OPMERKING: Deze preparatie wordt uitgevoerd voor het overbrengen van geïnfecteerde enkelvoudige cellen naar een nieuwe celdrager.
   1. Behandel de amoeben in de cultuur met een antimicrobieel middel dat bevat 10 µg/mL van vancomycine, 10 µg/mL van imipenem, 20 µg/mL van ciprofloxacine, 20 µg/mL van doxycycline, en 20 µg/mL van voriconazol. Dit mengsel wordt gebruikt om bacteriële en schimmelinfecties te voorkomen.
      OPMERKING: De procedure vindt plaats op een werkbank buiten het microbiologische veiligheidskabinet. Voeg 2 mL amoeben toe, geconcentreerd op 1 x 10⁶ cellen/mL in elk van de 15 Petrischalen. Incubeer de cultuur voor de aanhechting van de amoeben bij 30 °C gedurende 30 min.
2. Selecteer de Petrischaal die gebruikt is voor de micro-aspiratie uit de limietverdunning op basis van de volgende criteria: 1) afwezigheid van enige zichtbare contaminatie door schimmels en bacteriën, 2) bewijs van cytopathisch effect van de amoeben door de virussen en 3) de prelyse- en afrondingsfase van de amoeben (om aspiratie van virale partikels te vermijden).
3. Richt een werkstation in met de volgende materialen (Figuur 1A,BMicromanipulator, waarmee de microcapillair kan worden gepositioneerd; handmatige drukregelaar, gebruikt om de cellen in de microcapillair te aspireren en vrij te laten; omgekeerde microscoop; plug-and-play motormodules; camera; computermodule voor het visualiseren van de manipulatie en het maken van foto's.
4. Kies een microcapillair (Figuur 1C).
   OPMERKING: De grootte van de cellen, de vervorming en adhesie van hun membranen aan de oppervlakken en de cellulaire motiliteit kunnen het soepele verloop van de micro-aspiratie beïnvloeden. De diameter van de microcapillair kan nauwkeurig worden gekozen en aangepast aan specifieke celtypen, afhankelijk van hun grootte en de aspiratiemethoden. Een microcapillair van 20 µm binnendiameter werd gebruikt om een afronde amoebe te aspireren (diameter ~10 µm). Dit maakt het mogelijk om een interne positie te behouden en de cel gemakkelijk vrij te geven.
5. Installeer het systeem.
   1. Stel de werkhoek van het grijpsysteem op de gemotoriseerde module in op 45°.
   2. Voer een dubbele installatie uit, eerst op het grijpsysteem en vervolgens op de microcapillair.
   3. Stel de focus in op de cellen nadat er enkele druppels olie door de microcapillaire zijn geleid.
      OPMERKING: De biologisch compatibele minerale olie wordt door het apparaat geleverd.
   4. Voltooi de montage volgens de aanbevelingen van de fabrikant.
6. Kloon cellen (Figuur 2A,B)
   1. Plaats de petrischaal met 2 mL geïnfecteerde amoeben onder de microscoop.
   2. Focus eerst op de cellen, en vervolgens op de microcapillair die in de cultuur is ondergedompeld.
   3. Selecteer een afgeronde enkele cel en breng de microcapillair dichter naar de micromanipulator.
   4. Oefen zachte aspiratie uit op de cel met handmatige drukregeling, zodat deze in de microcapillair wordt gezogen. Verwijder de enkele cel uit het eerste monster en breng deze over naar de cellulaire ondersteuning, en incubeer deze vervolgens bij 30 °C.
   5. Voer dagelijks observaties uit met een omgekeerde optische microscoop om het uiterlijk van de cellen te bestuderen en het ontstaan van het cytopathisch effect te monitoren.

Tabel 1: Samenstelling van de kweekmedia

Resultaten

Figuur 1: Materialen voor micromanipulatie. (A) Werkelijke opstelling van het werkstation. (B) Schematische illustratie van de componenten van het werkstation. (C) Schematische illustratie van de microcapillair.

Figuur 2: Stappen van de micro-aspiratie. (A) Procedure voor isolatie van enkelvoudige cellen (zoom x40). (B) Schematische illustratie van de verschillende stappen van enkelvoudige cel-aspiratie: 1) Lokalisatie van de cel. 2) Aspiratie van de cel. 3) Loslatingsstap. De zwarte pijlen tonen de microcapillair en de witte pijlen tonen de enkelvoudige cel.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Corning cell culture flasks 150 cm²	Sigma-aldrich	CLS430825	Kweek
Corning cell culture flasks 25 cm²	Sigma-aldrich	CLS430639	Kweek
Corning cell culture flasks 75 cm²	Sigma-aldrich	CLS430641	Kweek
DFC 425C camera	LEICA	Unkown	Observatie/Monitoring
Eclipse TE2000-S Inverted Microscope	Nikon	Unkown	Observatie/Monitoring
Microcapillary 20 µm	Eppendorf	5175 107.004	Microaspiratie en vrijgave van cellen
Micromanipulator InjectMan NI2	Eppendorf	631-0210	Positionering van microcapillair
Petri dish 35 mm	Ibidi	81158	Kweek/observatie