Amoebe-gebaseerde verrijking van reuzenvirussen uit een watermonster uit het milieu

Samenvatting

Bron: Bou Khalil, J. Y.,et al. A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis. J. Vis. Exp. (2016)

Deze video demonstreert de verrijking van reuzenvirussen uit een watermonster uit het milieu met behulp van amoeben-gebaseerde co-cultuur om daaropvolgende detectie en analyse mogelijk te maken.

Protocol

1. Monstername

1. Verzamel 70 monsters uit verschillende omgevingen en regio's. Gebruik in dit geval het volgende: 5 vervuilde watermonsters uit het dorp Saint Pierre de Meyzoargues (Frankrijk), 15 monsters uit het meer in Parc Borély in Marseille (Frankrijk); 15 zeewatermonsters met sediment uit de rotsachtige inhammen bij Samena in Marseille (Frankrijk), 25 rivierwatermonsters uit de Alpen (Frankrijk), en tot slot 10 monsters van rioolwater in La Ciotat (Frankrijk).
2. Vortex de monsters voor homogenisatie vóór het inoculeren, gedurende één minuut bij kamertemperatuur zonder enige behandeling.

2. Isolatieprocedure

1. Voorbereiding van de gastheer voor blinde kweekprocedures en inoculatie van monsters
   1. Gebruik Vermamoeba vermiformis (stam CDC19) als celondersteuning voor de cocultuur.
   2. Kweek de amoeben bij 28 °C in een celkweekfles van 75 cm² met 30 ml protease-pepton-gistextract-glucose medium (PYG). Raadpleeg de samenstelling van PYG in Tabel 1.
      OPMERKING: Na 48 uur worden de amoeben gekwantificeerd via een normale telling met behulp van telplaten (bijv. Kovaslides).
   3. Oogst de cellen bij een concentratie van 5 x 10⁵ tot 10⁶ cellen/ml en pellet de amoeben door centrifugatie bij 720 x g gedurende 10 min.
   4. Verwijder het supernatant door aspiratie en resuspendeer de amoebepellet in 30 ml steriele Page's amoebale zoutoplossing (PAS) Tabel 1. Herhaal deze spoelprocedure.
   5. Resuspendeer de amoeben in 30 ml uithongeringsmedium met een mengsel van antibiotica en antifungalicum bij een concentratie van ongeveer 10⁶ amoeben/ml. Het uithongeringsmedium is een overlevingsmedium voor de amoebe, waardoor deze in leven kan blijven zonder incystering of vermenigvuldiging. Raadpleeg de samenstelling in Tabel 1.
      OPMERKING: Het mengsel van antimicrobiële middelen bevatte 10 µg/ml vancomycine, 10 µg/ml imipenem, 20 µg/ml ciprofloxacine, 20 µg/ml doxycycline en 20 µg/ml voriconazol. Dit mengsel diende om bacteriële en schimmelcontaminatie te verminderen, wat de virale vermenigvuldiging kan verlagen of beïnvloeden.
   6. Inoculeer 25 µl van elk monster direct op de 200 µl amoebenmonolaag in een 96-well plaat met platte bodem om de adhesie van de amoeben te bevorderen en incubeer bij 30 °C in een vochtige omgeving (een vochtige omgeving wordt gecreëerd door een nat kompres in de zak met de plaat te plaatsen om verdamping te voorkomen). Dit is de primocultuur. Laat twee wells met amoeben onbehandeld zonder inoculatie van een monster; dit dient als negatieve controle. Incubeer deze primocultuur gedurende drie dagen.
   7. Drie dagen na de eerste inoculatie wordt de primocultuurplaat gesubcultureerd op verse amoeben zoals hierboven beschreven, zonder microscopische observatie. Incubeer de nieuwe plaat gedurende drie dagen onder dezelfde omstandigheden als de primocultuur.
   8. Voer na deze drie dagen incubatie de finale kweek uit op dezelfde wijze als voor de primo- en subcultuur. Incubeer de finale kweek gedurende twee dagen. Ga vervolgens over tot detectie.

Tabel 1. Recepten voor oplossingen

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Protease-peptone-gistextract-glucose (PYG) medium, Page's amoebale saline (PAS), uithongeringsmedium	Eigen laboratoriumproductie	Marseille URMITE	x
Amoebestam CDC-19	ATCC	Frankrijk	50237
Platen	Cellstar	Frankrijk	655180
Kolfjes	SARSTEDT	Duitsland	833911
Ultracentrifuge Sorval WX 80	Thermo scientific	Frankrijk	9102448