Kwantificering van infectieus hepatitis C-virus middels fluorescentiemicroscopie

Samenvatting

Bron: Ren, S., et al. A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication. J. Vis. Exp. (2014)

Deze video demonstreert de fluorescentie-focus-assay die wordt gebruikt om infectieus hepatitise C-virus in celcultuur te kwantificeren. Het demonstreert de seriële verdunning van viraal supernatant, de infectie van hepatoomcellen en de detectie van virale replicatieplaatsen met behulp van antilichaamgebaseerde fluorescentiemicroscopie.

Protocol

1. Meten van de virustiter

1. Plate naïeve Huh-7.5.1-cellen uit tegen ongeveer 3 x 10³ cellen/well met gebruik van een 96-wells plaat. Voer de volgende dag 10-voudige seriële verdunningen uit van celvrij cultuursupernatans, geoogst van RNA-getransfecteerde cellen van het Hepatitis C-virus (HCV), met gebruik van groeimedium en inoculeer deze in triplo op Huh-7.5.1-cellen.
2. Fixeer de cellen 72 uur na infectie met methanol (gedurende 30 min bij -20 ºC) en voer een immunokleuring uit voor het HCV NS5A-eiwit.
3. Was de cellen drie keer met PBS en blokkeer met IFA-blokkeringsbuffer.
4. Gebruik een konijn polyklonaal primair anti-NS5A-antilichaam of een muis monoklonaal anti-dsRNA-antilichaam J2 bij een verdunning van 1:200 (1 μg/ml) en incubeer gedurende 5 uur tot overnacht bij 4 ºC.
5. Was de cellen drie keer met PBS na het primaire antilichaam.
6. Voeg een geit anti-konijn IgG-488 polyklonaal secundair antilichaam of een geit anti-muis IgG-594 polyklonaal secundair antilichaam toe bij een verdunning van 1:1.000 (1 μg/ml) en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
7. Was de cellen drie keer met PBS en observeer deze met een fluorescentiemicroscoop.
8. Gebruik de hoogste verdunning om de NS5A-positieve foci te tellen en bereken het gemiddelde aantal focus-forming units (FFU) per milliliter. Zie Figure 1 voor de HCV-titer.

Resultaten

Figuur 1. Onderzoek naar de infectiviteit van wild-type HCV en het meten van de virustiter. A) Naïeve Huh-7.5.1-cellen werden gebruikt voor infectiestudies. Het celvrije supernatant, verzameld op 48 en 96 uur na transfectie (hpt) van HCV RNA, werd onderworpen aan 10-voudige seriële verdunning en in drievoud toegevoegd aan de cellen in een 96-wellplaat. 72 uur na infectie werden de cellen gefixeerd en immunokleuring uitgevoerd voor het HCV NS5A-eiwit. De cellen met NS5A-positieve kleuring (rood) zijn geïnfecteerd met het virus. Voor de bepaling van de Focus Forming Unit (FFU) werden de positieve foci bij de hoogste verdunning geteld. Representatieve afbeeldingen zijn getoond (Schaalbalk 100 μm). B) De gemiddelde waarden en standaarddeviaties van de virustiter in FFU per milliliter zijn weergegeven in de grafiek. De polymerase-null mutant produceerde geen infectieuze deeltjes. WT: wild-type; Pol-: polymerase-null.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Fisher Scientific	10-017-CV
Huh-7.5.1	The Scripps Research Institute		De cellijn is vriendelijk ter beschikking gesteld door Dr. Francis Chisari aan Dr. Arumugaswami onder een getekende MTA tussen The Scripps Research Institute en het Cedars-Sinai Medical Center
Muis monoklonaal anti-dsRNA antilichaam J2	English & Scientific Consulting Kft.	10010200
Geit anti-konijn IgG Alexa Fluor 488	Life Technologies	A11008
Geit anti-konijn IgG Alexa Fluor 594	Life Technologies	A11020