Visualisatie van transcriptionele suppressie in virusgeïnfecteerde cellen

Samenvatting

Bron: Kalveram, B. et al. Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis. J. Vis. Exp. (2013)

Deze video demonstreert het gebruik van clickchemie en fluorescentiemicroscopie om nascente RNA-transcriptie in zoogdiercellen te visualiseren. Er wordt belicht hoe virale infectie de transcriptie van de gastheer onderdrukt door fluorescente signalen tussen geïnfecteerde cellen en controlecellen te vergelijken.

Protocol

1. Infecteer cellen met Rift Valley-koortsvirus (RVFV) stam MP-12 en label nascent RNA met 5-ethynyluridine (EU)

   1. Zaai humane embryonale nier 293 (HEK293) cellen uit in een 6-wells weefselkweekplaat in groeimedium (Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) bevattende 10% foetaal runderserum, 100 U/mL penicilline, 100 μg/mL streptomycine). Incubeer in een bevochtigde incubator op 37 °C en 5% CO₂ totdat de cellen een confluentie van 80 - 100% hebben bereikt.
   2. Infecteer cellen met MP-12 bij een multipliciteit van infectie (MOI) van 3. Neem ten minste twee niet-geïnfecteerde wells op: één van de twee wells dient als niet-geïnfecteerde controle, de andere wordt behandeld met actinomycine D (ActD). Verwijder het groeimedium en verdun de virusstock zodanig dat het totale volume dat aan elke well wordt toegevoegd 400 μL is. Incubeer gedurende 1 uur in een bevochtigde incubator op 37 °C en 5% CO₂.
   3. Verwijder het inoculum en voeg 2 mL vers groeimedium per well toe. Incubeer op 37 °C gedurende 12 uur.

   OPMERKING: Indien dit protocol wordt aangepast voor gebruik met een ander virus, is het raadzaam om een tijdreeks-experiment uit te voeren om het optimale tijdstip voor labeling en oogsten te bepalen. Stel deze tijdreeks zo in dat de infectietijden versprongen zijn, zodat alle monsters gelijktijdig gelabeld, geoogst en gekleurd kunnen worden.

   4. Op 12 uur na infectie (hpi), vervang het groeimedium door een medium bevattende 0,5 mM EU. Voeg aan één van de mock-geïnfecteerde wells ook 5 μg/mL ActD toe. Dit dient als controle voor transcriptionele suppressie, aangezien ActD DNA-afhankelijke RNA-synthese remt. Plaats de cellen terug in de incubator.
   5. Op 13 hpi, was de cellen één keer met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en oogst ze door trypsinisatie. Was de geoogste cellen drie keer met PBS bevattende 1 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA).

   OPMERKING: Centrifugeer de cellen tijdens deze en volgende stappen niet sneller dan 500-1.000 x g om celbreuk te voorkomen. Centrifugeer de cellen 1-2 min om ze te sedimenteren.

   OPMERKING: Indien er na de click-reactie oppervlakte-immunokleuring is gepland, oogst dan in plaats daarvan met een rubberen policeman of een wegwerpcelschraper.

   6. Fixeer de cellen door ze te resuspenderen in 1 mL 4% paraformaldehyde (PFA) en incubeer gedurende 30 min bij kamertemperatuur (RT).
   7. Was één keer met 1 mL PBS-EDTA per well. Ga direct over naar stap 2.

   OPMERKING: Het is belangrijk om onmiddellijk met de click-reactie te beginnen, aangezien het RNA degradeert als het in dit stadium gedurende langere tijd wordt bewaard. Indien er een tijdreeks-experiment wordt uitgevoerd, zorg er dan voor dat alle monsters gelijktijdig worden gelabeld, gefixeerd en gekleurd.

2. Click-reactie voor detectie van gelabeld RNA

   1. Permeabiliseer de cellen door 1 ml 0,2% Triton X-100 in PBS toe te voegen. Incubeer gedurende 10 min bij RT.

   OPMERKING: Alle oplossingen die worden gebruikt in stappen 2.1 tot 2.3 moeten nucleasevrij zijn.

   2. Was drie keer met 1 ml PBS per well.
   3. Verwijder de dekglasjes uit de 12-wells plaat en breng deze over naar een bevochtigingskamer. Bedek elk dekglasje met 50 - 100 μl click-kleuringsoplossing (100 mM Tris pH 8,5, 1 mM CuSO₄, 20 μM fluorescent azide [maximum excitatie/emissie: 590/617 nm], 100 mM ascorbinezuur). Incubeer gedurende 1 uur bij RT in het donker.

   OPMERKING: Om de bevochtigingskamer te assembleren, bekleedt u de bodem van een celkweek- of petrischaal met een diameter van 10 cm met plastic paraffinefolie. Bekleed de binnenkant van de rand van de schaal met vochtige papieren handdoeken. Plaats de dekglasjes op de plastic paraffinefolie.

   OPMERKING: Let erop dat de dekglasjes niet uitdrogen tijdens deze of enige andere stap in het protocol. Het is het beste om de kleuringsoplossing aan elk dekglasje toe te voegen direct nadat het in de bevochtigingskamer is geplaatst.

   OPMERKING: Bereid de click-kleuringsoplossing vers voor vlak voor deze stap. Stockoplossingen van 1,5 M Tris pH 8,5, 100 mM CuSO₄ en 500 mM ascorbinezuur kunnen worden bewaard op 4 °C. Gooi echter elke ascorbinezuur-stockoplossing weg die geel is geworden.

   OPMERKING: Zorg ervoor dat u een fluorofoor kiest die overeenstemt met de filters op uw fluorescentiemicroscoop.

   4. Verwijder de dekglasjes uit de bevochtigingskamer, plaats ze in een nieuwe 12-wells plaat en was drie keer met 1 ml PBS per well.
   5. Monteer de dekglasjes door één druppel (ongeveer 15 μl) Fluoromount-G op een microscoopglas te plaatsen. Dip het dekglasje in H₂O, verwijder overtollig H₂O door de zijkant tegen een papieren handdoek te drukken, en plaats het met de celzijde naar beneden in de druppel Fluoromount-G. Laat 5 min aan de lucht drogen.

   OPMERKING: Indien er wordt geïmageerd op een omgekeerde microscoop, laat Fluoromount-G dan overnacht stollen op 4 °C of bevestig de dekglasjes op het microscoopglas door de rand af te dichten met transparante nagellak.

   OPMERKING: Preparaten kunnen direct worden geïmageerd of tot een week in het donker op 4 °C worden bewaard.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
5-Ethynyl uridine	Berry Associates	PY 7563	Oplossen in DMSO voor 100 mM stockoplossing
Rond dekglas van 12 mm	Fisherbrand	12-545-82
Actinomycine D (ActD)	Sigma	9415	Oplossen in DMSO voor 10 mM stockoplossing
Fluorescentiemicroscoop			bijv. Olympus IX71
CuSO₄	Sigma	C-8027	Oplossen in H₂O voor 100 mM stockoplossing
DMEM (Dulbecco's modified eagle medium)	Invitrogen	11965092
FBS (Foetaal bovien serum)	Invitrogen	16000044
Fluorescent azid (gekoppeld aan Alexa Fluor 594)	Invitrogen	A10270
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
L-ascorbinezuur	Sigma	A-5960	Oplossen in H₂O voor 500 mM
Paraformaldehyde	Sigma	158127
Penicilline-streptomycine	Invitrogen	15140122
Triton X-100	Sigma	T-8787
Trypsine-EDTA	Invitrogen	25200056
Trizma base	Sigma	T-1503	oplossen in H₂O voor 1,5 M stockoplossing, pH 8,5