Analyse van virus-geïnduceerde transcriptionele suppressie van de gastheer met behulp van flowcytometrie

Samenvatting

Bron: Kalveram, B., et al. Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis. J. Vis. Exp. (2013)

Deze video demonstreert het gebruik van click-chemie en flowcytometrie om de door virussen geïnduceerde onderdrukking van de transcriptie van gastcellen te meten. Zoogdiercellen worden geïnfecteerd met een virus dat een nucleair virulentie-eiwit tot expressie brengt dat het transcriptiefactorcomplex van de gastheer verstoort, terwijl controlecellen transcriptioneel actief blijven. Inbouw van 5-ethynyluridine labelt nieuw gesynthetiseerd mRNA, waardoor kwantificering van de transcriptionele activiteit in geïnfecteerde cellen en controlecellen mogelijk wordt via dubbele fluorescentiedetectie.

Protocol

1. Infecteer cellen met MP-12 en label nascent RNA met 5-ethynyluridine (EU)

1. Zaai 293-cellen uit in een 6-wells weefselkweekplaat in groeimedium (DMEM bevattende 10% foetaal runderserum, 100 U/ml Penicilline, 100 μg/ml Streptomycine). Incubeer in een bevochtigde incubator bij 37 °C en 5% CO₂ totdat de cellen een confluentie van 80 - 100% hebben bereikt.
2. Infecteer de cellen met MP-12 bij een m.o.i. van 3. Neem ten minste twee niet-geïnfecteerde wells mee: één van de twee wells dient als niet-geïnfecteerde controle, de andere wordt in stap 1.4 behandeld met ActD. Verwijder het groeimedium en verdun de virusstock zodanig dat het totale volume dat aan elke well wordt toegevoegd 400 μl is. Incubeer gedurende 1 uur in een bevochtigde incubator bij 37 °C en 5% CO₂.
3. Verwijder het inoculum en voeg 2 ml vers groeimedium per well toe. Incubeer gedurende 12 uur bij 37 °C.

OPMERKING: Indien dit protocol wordt aangepast voor gebruik met een ander virus, is het raadzaam om een tijdreeks-experiment uit te voeren om het optimale tijdstip voor labelen en oogsten te bepalen. Stel deze tijdreeks zo in dat de infectietijden versprongen zijn, zodat alle monsters gelijktijdig gelabeld, geoogst en gekleurd kunnen worden.

4. Vervang na 12 h.p.i. het groeimedium door een medium dat 0,5 mM EU bevat. Voeg aan een van de schijn-geïnfecteerde wells ook 5 μg/ml ActD toe. Dit dient als controle voor transcriptionele suppressie, aangezien ActD de DNA-afhankelijke RNA-synthese remt. Plaats de cellen terug in de incubator.
5. Was de cellen na 13 h.p.i. één keer met PBS en oogst ze door trypsinisatie van de cellen. Was de geoogste cellen drie keer met PBS bevatten 1 mM EDTA (PBS-EDTA).

OPMERKING: Centrifugeer de cellen tijdens deze en volgende stappen niet sneller dan 500 - 1,000 x g om celbreuk te voorkomen. Centrifugeer de cellen 1-2 min om ze te sedimenteren.

OPMERKING: Als er na de click-reactie een oppervlakte-immunokleuring is gepland, oogst de cellen dan in plaats daarvan met een rubberen policeman of een wegwerpcelschraper.

6. Fixeer de cellen door ze opnieuw te suspenderen in 1 ml 4% PFA en incubeer gedurende 30 min bij RT.
7. Was één keer met 1 ml PBS-EDTA per well. Ga onmiddellijk over naar stap 6.

OPMERKING: Het is belangrijk om onmiddellijk door te gaan met de click-reactie, aangezien het RNA degradeert als het in dit stadium gedurende langere tijd wordt bewaard. Wanneer er een tijdreeksexperiment wordt uitgevoerd, moet er bovendien worden gewaakt over het gelijktijdig labelen, fixeren en kleuren van alle monsters.

2. Clickreactie voor het detecteren van gelabeld RNA

1. Permeabiliseer de cellen door deze opnieuw te suspenderen in 0,5 ml 0,2% Triton X-100 in PBS. Incubeer gedurende 10 min bij RT.

OPMERKING: Alle oplossingen die in stappen 2.1 tot 2.3 worden gebruikt, moeten nucleasevrij zijn. Als de cellen tijdens deze stap niet correct sedimenteren, verleng dan de centrifugatietijd naar 5 min. Het sedimentatiegedrag zal verbeteren zodra de cellen zijn gesuspendeerd in de FACS-buffer.

2. Was één keer met 1 ml PBS.

OPMERKING: Gebruik in deze stap geen EDTA, omdat dit de Cu²⁺-ionen zal chelateren die nodig zijn voor de clickreactie.

3. Resuspendeer de cellen in 200 μl click-kleuringsoplossing (100 mM Tris pH 8.5, 1 mM CuSO4, 200nM azide gelabeld met fluorescerende kleurstof [maximum excitatie/emissie: 650/665 nm], 100 mM ascorbinezuur). Incubeer gedurende 1 uur bij RT in het donker.

OPMERKING: Bereid de click-kleuringsoplossing vers voor vlak voor deze stap. Stamoplossingen van 1.5 M Tris pH 8.5, 100 mM CuSO₄ en 500 mM ascorbinezuur kunnen worden bewaard bij 4 °C. Gooi echter elke stamoplossing van ascorbinezuur weg die geel is geworden. Als cellen tijdens deze stap gaan klonteren, resuspendeer deze dan door meerdere keren op en neer te pipetteren. Zorg ervoor dat u een fluorofoor kiest die kan worden gedetecteerd door uw flowcytometer. Bereid daarnaast één monster voor van geïnfecteerde cellen die niet worden onderworpen aan de click-kleuringsprocedure; deze zijn nodig voor de kalibratie van de flowcytometer. Gebruik hiervoor ofwel de helft van de geïnfecteerde cellen, of voeg bij stap 1.2 een extra geïnfecteerde well toe.

Was tweemaal met FACS-buffer (PBS bevattend 1 mM EDTA en 0,5% (w/v) BSA).

3. Immunofluorescentie om de expressie van virale eiwitten te detecteren

1. Resuspendeer de cellen in 200 μl primair antilichaam (anti-RVFV) verdund in FACS-buffer (1:10.000) en incubeer gedurende 1 uur bij RT in het donker.

OPMERKING: Alternatief kan deze stap overnacht worden uitgevoerd bij 4 °C in het donker.

OPMERKING: Bereid ook één monster voor van niet-geïnfecteerde cellen die wel aan de click-kleuringsprocedure zijn onderworpen, maar niet immunogekleurd zullen worden; deze zijn nodig voor de kalibratie van de flowcytometer. Gebruik hiervoor ofwel de helft van de schijngeïnfecteerde cellen, of voeg bij stap 1.2 een extra niet-geïnfecteerd well toe.

OPMERKING: Bepaal eerst de optimale verdunning voor uw primaire antilichaam wanneer u dit protocol aanpast voor gebruik met een ander virus.

2. Was de cellen twee keer met de FACS-buffer.
3. Resuspendeer de cellen in 200 μl secundair antilichaam (anti-muis IgG geconjugeerd aan fluorescerende kleurstof [maximum excitatie/emissie: 495/519 nm]) verdund in FACS-buffer (1:1.000) en incubeer gedurende 1 uur bij RT in het donker.
4. Was de cellen één keer met de FACS-buffer.

OPMERKING: Op dit punt kunnen de cellen gedurende de nacht (O/N) bij 4 °C in het donker worden bewaard.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
5-ethynyl-uridine	Berry Associates	PY 7563	oplossen in DMSO voor 100 mM stockoplossing
ronde dekglasjes van 12 mm	Fisherbrand	12-545-82
polystyreen buisjes van 5 ml	BD Biosciences	352058
Actinomycine D (ActD)	Sigma	9415	oplossen in DMSO voor 10 mM stockoplossing
Alexa Fluor 488 geit anti-muis IgG	Invitrogen	A-11029
Bovien serumalbumine (BSA)	Santa Cruz	sc-2323
CuSO₄	Sigma	C-8027	oplossen in H2O voor 100 mM stockoplossing
DAPI	Sigma	D-9542	oplossen in H2O voor 5 mg/ml stockoplossing
DMEM	Invitrogen	11965092
FBS	Invitrogen	16000044
fluorescerend azide (gekoppeld aan Alexa Fluor 594)	Invitrogen	A10270
fluorescerend azide (gekoppeld aan Alexa Fluor 657)	Invitrogen	A10277
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
L-ascorbinezuur	Sigma	A-5960	oplossen in H2O voor 500 mM
filterpapier	VWRbrand	28333-087
paraformaldehyde	Sigma	158127
Penicilline-Streptomycine	Invitrogen	15140122
poly-L-lysine (MW ≥ 70000)	Sigma	P1274
Triton X-100	Sigma	T-8787
Trizma base	Sigma	T-1503	oplossen in H2O voor 1,5 M stockoplossing, pH 8,5
Trypsine-EDTA	Invitrogen	25200056
Fluorescentiemicroscoop			bijv. Olympus IX71
Flowcytometer			bijv. BD Biosciences LSRII Fortessa