Productie van retrovirale particles voor gentransfer

Samenvatting

Bron: Zjablovskaja, P., et al., Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells. J. Vis. Exp. (2018)

Deze video demonstreert de productie van recombinante retrovirale deeltjes door het transfecteren van packagingcellen afgeleid van de menselijke nier, wat een stabiele genoverdracht naar doelcellen mogelijk maakt voor downstream-toepassingen zoals genetische modificatie, functionele assays of studies naar lijndifferentiatie.

Protocol

1. Productie van retrovirus
   1. Plat een suspensie van enkele Bosc23-cellen (6 × 10⁶) uit in een Petrischaal van 16 cm en kweek deze in 18 mL DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) met 10% FBS (foetaal bovien serum) tot de confluentie van de cultuur 80 % bereikt (24 u).
      OPMERKING: Cellen moeten in een monolaag groeien en mogen geen klonten vormen in de cultuur. Celtelling kan met verschillende methoden worden uitgevoerd (geldig voor de rest van de hier gepresenteerde protocollen). Bij een klein aantal monsters wordt handmatig tellen onder de microscoop met de Bürker-kamer aanbevolen. Gebruik in dat geval Trypaanblauw voor de exclusie van dode cellen. Meng de cellen in een verhouding van 1:1 met 0,4% Trypaanblauw in PBS (fosfaatgebufferde zoutoplossing). Voor het tellen van een groot aantal monsters kan een automatische celsteller worden gebruikt.
   2. Combineer 40 µg retroviraal construct (zoals MSCV), 20 µg pCL-Eco (verpakkingsvector), 80 µl PEI (polyethylenimine) en 2 mL medium met verlaagd serumgehalte (bijv. Opti-MEM (Minimum Essential Medium)) (zonder antibiotica). Incubeer dit mengsel 20 min bij kamertemperatuur (RT).
   3. Vervang voorzichtig het medium van de Bosc23-cellen door 16 mL DMEM aangevuld met 2% FBS. Warm het medium voor tot 37 °C voor gebruik.
      OPMERKING: Gebruik geen antibiotica tijdens de transfectie, omdat deze de transfectie-efficiëntie kunnen verlagen.
   4. Voeg het in stap 1.2 bereide mengsel druppelsgewijs en voorzichtig toe aan de Bosc23-cultuur en incubeer 4 u bij 37 °C. Beperk de incubatie tot minder dan 6 u vanwege de toxiciteit van PEI.
   5. Vervang na incubatie het Bosc23-medium door 18 mL voorverwarmd DMEM met 10% FBS en kweek de cellen 48 u bij 37 °C. Plaats de schalen in een laboratorium met biosafety level 2 en volg de standaard veiligheidsprocedures.
   6. Verzamel het Bosc23-medium (dat ecotroope retrovirale deeltjes bevat) met een serologische pipet van 25 mL in een conische buis van 50 mL en bewaar dit bij 4 °C.
      OPMERKING: (Belangrijk) De transfectie-efficiëntie moet 90% bereiken om een virus met een hoge titer te produceren.
   7. Voeg 18 mL voorverwarmd DMEM 10% FBS toe aan de Bosc23-cellen en kweek deze 24 u.
   8. Herhaal stap 1.6.
      OPMERKING: Retrovirale supernatanten uit 1.6 en 1.8 kunnen worden samengevoegd zodra ze dezelfde temperatuur (4 °C) hebben bereikt om de virale integriteit te bewaren.
   9. Om Bosc23-contaminatie in de virale supernatanten te voorkomen, wordt het verzamelde virus gecentrifugeerd bij 1500 × g gedurende 10 min bij 4 °C. Verdeel het virus in aliquots, vries het snel in met droogijs of vloeibare stikstof en bewaar het bij -80 °C. Houd er echter rekening mee dat vers bereid virus een hogere kwaliteit heeft wat betreft infectie-efficiëntie dan ingevroren voorraden.
      OPMERKING: (Belangrijk) Vermijd herhaaldelijk invriezen/ontdooien van het virus, aangezien dit leidt tot virale degradatie.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	15028
Opti-MEM ((Minimum Essential Medium) - Medium met verlaagd serumgehalte	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	31985-047	L-Glutamine, Fenolrood
Foetaal runderserum (FBS)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	10270	Gebruikt voor het kweken van HEK293T-, NIH3T3- en BOSC23-cellen
Penicilline	Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)	P3032
Streptomycine	Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)	S9137	Streptomycinesulfaat-zoutpoeder
Gentamicine	Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)	G1914
Polyethylenimine	Polyscience, Warrington, PA, USA	23966	Lineair, MW 25.000 (PEI 25000)