Generatie van GFP-gelabeld recombinant respiratoir syncytieel virus met gebruik van een T7-expressiesysteem

Samenvatting

Bron: Bouillier, C. et. al., Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses. J. Vis. Exp. (2019)

Deze video demonstreert de generatie van een recombinant respiratoir syncytieel virus dat groen fluorescent eiwit (GFP) tot expressie brengt, met behulp van een T7-gebaseerd reverse genetics-systeem. De co-transfectie van plasmiden die virale eiwitten coderen en een GFP-getagd genoom leidt tot eiwitexpressie en initieert de rescue van het virus.

Protocol

1. Rescue en eerste passage van recombinant virus

OPMERKING: Voer alle volgende stappen uit in een steriele omgeving, met gebruik van een veiligheidskast klasse II.

1. Maak de dag vóór de transfectie een suspensie van de BSRT7/5-cellijn met een concentratie van 5 x 10⁵ cellen/mL in compleet medium. Verdeel 2 mL cel-suspensie per putje in een 6-wells plaat. Bereid één putje voor per virus dat gerescued zal worden en één extra putje voor een negatieve controle. Incubeer de plaat bij 37 °C en 5% CO2₂Controleer de volgende dag of de cellen een confluentie van 80%–90% hebben bereikt.
2. Ontdooi de reverse genetics respiratory syncytial virus (RSV)-vectoren p-RSV-GFP en p-RSV-M2-1-GFP, alsmede p-N, p-P, p-L en p-M2-1. Meng, voor elk te redden virus, 1 µg van p-N en p-P, 0.5 µg van p-L, 0.25 µg van p-M2-1, en 1.25 µg van p-RSV (GFP of M2-1 GFP) in een buisje.
   OPMERKING: Er kunnen verschillende expressievectoren worden gebruikt voor virale eiwitten van het polymerasecomplex (N, P, L en M2-1); de verhouding tussen de eiwitten moet echter gehandhaafd blijven. Voer de negatieve controle uit door de p-RSV-vector te vervangen door een lege vector.
3. Ga over tot transfectie (zie Tabel met Materialen).
   1. Voeg toe 250 µL van medium met verlaagd serum bij de gemengde vectoren. Verdun in een andere buis 10 µL van het transfectiereagens in 250 µL van medium met verlaagd serumgehalte. Vortex beide buizen voorzichtig en wacht 5 minuten. Meng de inhoud van beide buizen en laat dit 20 minuten bij kamertemperatuur staan.
   2. Spoel de BSRT7/5-cellen met 1 mL medium met verlaagd serumgehalte en verdeel 1,5 mL Minimal Essential Medium (MEM) met 10% foetaal kalfsserum (FCS) zonder antibiotica per well. Indien nodig, incubeer bij 37 °C en 5% CO2₂ totdat de incubatie beschreven in stap 1.3.1 is voltooid.
   3. Voeg toe 500 µL van het in stap 1.3.1 bereide transfectiemengsel aan een put zodra de incubatietijd van 20 min is verstreken. Plaats de cellen in de incubator bij 37 °C en 5% CO2₂ gedurende 3 dagen. Vervang het kweekmedium van de cellen niet tijdens de transfectie.
4. Observeer één keer per dag de fluorescentie van het groen fluorescerend eiwit (GFP) (excitatie bij 488 nm en emissie bij 515–535 nm) onder een omgekeerde fluorescentiemicroscoop bij een 20x vergroting met behulp van het GFP-filter om de efficiëntie van de rescue te monitoren.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
BSRT7/5		niet commercieel verkrijgbaar	Zie referentie 22. Buchholz et al. 1999
Fluorescentiemicroscoop voor observaties	Olympus	IX73 Olympus microscope
Fluorescentiemicroscoop voor videomicroscopie	Olympus	ScanR Olympus microscope
HEp-2	ATCC	ATCC CCL-23
HEPES ≥99,5%	Sigma	H3375
L-Glutamine (200 mM)	ThermoFisher Scientific	25030024
Lipofactamine 2000 reagens	ThermoFisher Scientific	11668019	Protocol in stap 2.3. is geoptimaliseerd voor dit reagens.
MEM (10x), zonder glutamine	ThermoFisher Scientific	11430030
MEM, GlutaMAX supplement	ThermoFisher Scientific	41090-028
MgSO4 ReagentPlus, ≥99,5%	Sigma	M7506
Opti-MEM I medium met verminderde serumconcentratie	ThermoFisher Scientific	51985-026
Plasmiden		niet commercieel verkrijgbaar	Zie referentie 21. Rameix-Welti et al. 2014