Plaque-titratie-assay voor de kwantificering van infectieus respiratoir syncytiaal virus

Samenvatting

Bron: Bouillier, C., et al. Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses. J. Vis. Exp. (2019)

De video demonstreert een plaque-titratie-assay die wordt gebruikt om infectieus recombinant respiratoir syncytieel virus (RSV) in epitheliale cellagen te kwantificeren. Er wordt getoond hoe gastcellen worden geïnfecteerd met seriële verdunningen van virale suspensies, hoe de verspreiding van het virus wordt beperkt door een semi-solide overlay op basis van cellulose, en hoe lokale plaques ontstaan door cytopathische effecten. De procedure wordt afgesloten met kleuring, decontamination en het tellen van de plaques om de virale titer te bepalen en de RSV-infectiviteit te beoordelen.

Protocol

1. Plaque-titratie-assay

1. Bereid de 12-well platen voor titratie voor op de dag voordat de titratie-assay wordt uitgevoerd (zes wells zijn nodig om één buis virus te titreren). Zaai de wells met 1 mL menselijke epitheeltype-2 (HEp-2) cellen bij 5 × 10⁵ cellen/mL in compleet medium.
2. Bereid de volgende dag een steriele microkristallijne cellulose-suspensie (2,4% [w/v] in water) (zie Tabel van Materialen).
   1. Dispergeer 2,4 g microkristallijn cellulosepoeder in 100 mL gedestilleerd water met een standaard magnetische roerder, tot het poeder volledig is opgelost (meestal 4–12 u). Autoclaveer de suspensie bij 121 °C gedurende 20 min en bewaar deze bij kamertemperatuur voor gebruik.
      OPMERKING: Onder deze omstandigheden is de suspensie 1 jaar stabiel.
   2. Bewaar de oplossing na opening in een steriele omgeving gedurende 6 maanden bij 4 °C. Meng de suspensie altijd voor gebruik (door handmatig te schudden of te vortexen) om te garanderen dat deze homogeen is.
3. Bereid het 2× minimum essential medium (MEM) voor in een steriele omgeving. Verdun commercieel MEM 10× met steriel water en voeg L-glutamine, 1.000 units/mL penicilline en 1 mg/mL streptomycine toe. Schud de verdunning krachtig en bewaar deze bij 4 °C.
   OPMERKING: Voer stappen 1.4–1.10 uit in een steriele omgeving met gebruik van een veiligheidskast klasse II.
4. Bereid zes buisjes voor die elk 900 µL MEM zonder foetaal kalfsserum (FCS) bevatten per te titreren virus (de titratiebuisjes). Ontdooi de virusaliquots, vortex deze krachtig gedurende 5 s en breng 100 µL over naar het eerste titratiebuisje.
5. Voer een tienvoudige verdunning 6× uit, als volgt. Voeg 100 μL virus toe aan 900 μL medium in het eerste buisje, sluit het buisje en meng de inhoud door enkele seconden te vortexen. Vervang de pipetpunt, voeg 100 µL van de eerste verdunning toe aan 900 µL medium in het tweede buisje, sluit het buisje en vortex. Herhaal de procedure tot aan het zesde buisje.
   OPMERKING: Het is zeer belangrijk om voor elke verdunning de punt te vervangen.
6. Schrijf de virusnaam en de verdunningsfactoren op de HEp-2 12-well platen. Zet een markering om de plaat en het deksel met elkaar te koppelen, omdat deze tijdens het kleuren (stap 1.9) gescheiden kunnen raken. Verwijder het medium uit de platen en verdeel 400 µL van één verdunning per well. Incubeer de platen bij 37 °C gedurende 2 u voor virusadsorptie.
   OPMERKING: Vervang de pipetpunt tussen elk inoculum of werk met dezelfde punt van de laagste naar de hoogste concentratie. Inoculeer een beperkt aantal platen (1 tot 2) gelijktijdig om te voorkomen dat de cellen uitdrogen.
7. Bereid de microkristallijne cellulose-overlay voor tijdens de virusadsorptie (extemporane bereiding). Om 100 mL overlay te verkrijgen, mengt u 10 mL 2,4% microkristallijne cellulose-suspensie, 10 mL 2× MEM en 80 mL MEM met 2% FCS.
   1. Stel de pH van het 2× MEM in op ongeveer 7,2 met een steriele natriumbicarbonaatoplossing van 7,5%, aan de hand van de kleurindicator. Voeg de microkristallijne cellulose-suspensie en het MEM toe en meng krachtig.
8. Voeg aan het einde van de incubatie van 2 u 2 tot 3 mL overlay toe aan elke well van de 12-well platen zonder het inoculum te verwijderen. Wees voorzichtig om contaminatie van aangrenzende wells met inocula met een hoog virustiter te voorkomen. Incubeer de plaat bij 37 °C en 5% CO₂ gedurende 6 dagen. Verplaats de plaat en de incubator niet tijdens de incubatie.
9. Ga over tot het kleuren van de cellen met een kristalvioletoplossing (8% kristalviolet [v/v], 2% formaldehyde [v/v] en 20% ethanol [v/v] in water).
   1. Bescherm het werkoppervlak van de veiligheidskast met een vel (kristalviolet kleurt oppervlakken sterk).
   2. Schud de platen voorzichtig om de microkristallijne cellulose-overlay te verwijderen. Verwijder de supernatanten en was de cellen 2× met 1× fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Behandel de platen één voor één om te voorkomen dat de cellen uitdrogen. Voeg 1–2 mL van de kristalvioletoplossing toe en wacht 10–15 min. Verwijder de oplossing, die kan worden hergebruikt voor het kleuren van volgende platen.
   3. Dompel de platen en deksels enkele seconden onder in verse bleekoplossing en was ze vervolgens grondig met kraanwater. Let op dat de platen en kappen door de bleekoplossing worden gedecontamineerd.
   4. Leg de platen en deksels op papieren handdoeken en laat ze drogen. Droog de platen bij omgevingstemperatuur na het spoelen met water en bewaar ze bij kamertemperatuur. Bewaar de platen bij langdurige opslag (maanden) beschermd tegen licht om de kleur te behouden. Let op dat als de cellen hun kleur verliezen, ze opnieuw kunnen worden gekleurd met kristalviolet.
10. Bereken de virustiters. Tel de plaques in de wells van de droge platen die met het blote oog zichtbaar zijn. Controleer of het aantal plaques van de verschillende verdunningen coherent is (factor 10 tussen elke verdunning). Kies de well waarin de plaques het gemakkelijkst te tellen zijn. Bepaal het aantal plaques ten opzichte van het inoculumvolume en de verdunning.
    OPMERKING: In het voorbeeld in Figuur 1 worden 21 plaques geteld bij de 10^-5 verdunning. Deze komen overeen met een titer van

Resultaten

Figuur 1: Bepaling van de RSV-titer met behulp van de plaque-assay. (A) Resultaten van de plaque-titratie-assay in een 12-well plaat. De zes wells die zijn geïnfecteerd met seriële verdunningen van één virale stock worden getoond. Verdunningen zijn aangegeven in een logaritme met grondtal 10. Cellen geïnfecteerd met de eerste drie verdunningen zijn allemaal losgekomen. De waargenomen plaque-aantallen bij de 10^-4, 10^-5 en 10^-6 verdunningen zijn consistent. (B) Illustratie van de plaque-telling (gele nummers). De groene ster geeft krassen op de cellaag aan.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Kristalvioletoplossing	Sigma	HT90132
HEp-2	ATCC	ATCC CCL-23
MEM (10x), zonder glutamine	ThermoFisher Scientific	11430030
MEM, GlutaMAX-supplement	ThermoFisher Scientific	41090-028
Natriumbicarbonatoplossing 7,5%	ThermoFisher Scientific	25080094
Penicilline-streptomycine (10.000 U/mL)	ThermoFisher Scientific	15140122