Beoordeling van de virale replicatiecapaciteit met behulp van een radiogestempelde reverse-transcriptase-assay

Samenvatting

Bron: Claiborne, D. T. et al. A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses. J. Vis. Exp. (2014)

Deze video demonstreert de bepaling van de virale replicatiecapaciteit met behulp van een radiogemarkeerde reverse transcriptase-assay. Cultuursupernatanten die nakomelingen-virionen bevatten, worden toegevoegd aan een reverse transcriptiemengsel dat een radiogemarkeerde nucleotide bevat. Het geïncorporeerde signaal weerspiegelt de virale output en de replicatie-efficiëntie. Fosfor-imaging wordt gebruikt om signalen te detecteren en te vergelijken tussen de testmonsters en wild-type monsters.

Protocol

1. Analyse van reverse transcriptase (RT) in supernatanten van celculturen

1. Stel een biologische veiligheidswerkbank in een faciliteit met biosafety level 3 (BSL-3) in voor gebruik met radioactieve materialen.
   1. Plaats absorberend papier in de werkbank en vervang de aspirator door een aspirator die bestemd is voor radioactief gebruik. 
      OPMERKING: Alle radioactieve afvalstoffen moeten correct worden afgevoerd in overeenstemming met de veiligheidsvoorschriften.
2. Voeg 1-2 µl van 10 mCi/ml [α-³³P] deoxythymidine trifosfaat (dTTP) en 4 µl van 1 M dithiothreïtol (DTT) toe aan elk aliquot van 1 ml RT-mastermix (zie Tabel 1).
3. Meng elke 1,5 ml microcentrifugebuis met RT-mastermix, DTT en [α-³³P] dTTP voorzichtig met een 1.000 µl pipette en breng dit over naar een steriele goot.
4. Dispenseer 25 µl van de gelabelde RT-mix in elke put van een dunwandige polymerasekettingreactie (PCR)-plaat met 96 putjes. 
   OPMERKING: Houd ruimte vrij voor een positieve controle (MJ4 wild-type (WT) infectie) en een negatieve controle (mock-infectie).
5. Voeg 5 µl van elk supernatant toe aan de PCR-plaat die de RT-mastermix bevat.
6. Sluit de PCR-plaat af met een adhesieve folieafdekking en incubeer deze gedurende 2 uur bij 37 °C in een thermocycler. Spoel om veiligheidsredenen de pipetpuntjes om met Amphyl en voer de puntjes af in een klein reservoir met Amphyl-afval, dat later als radioactief afval wordt afgevoerd.
7. Maak na incubatie kleine gaatjes in de folieafdekking met een 200 µl multikanalspipet. 
   OPMERKING: Als de pipetpuntjes de vloeistof in de put raken, vervang de puntjes dan voordat u naar de volgende kolom of rij gaat.
8. Meng de monsters 5x en breng 5 µl van elk monster over op DE-81 papier. Laat dit 10 min aan de lucht drogen.
9. Was de blots 5x met 1x saline-natriumcitraat (SSC) en vervolgens 2x met 90% ethanol gedurende 5 min per wasbeurt. Laat aan de lucht drogen.
   1. Plaats elke blot in een apart wasreservoir, zoals een sandwich-opbergdoos, voeg voldoende wasbuffer (1x SSC of 90% ethanol (EtOH)) toe om de blot te bedekken en schud gedurende 5 min.
   2. Giet de wasbuffer af in een apart reservoir en herhaal dit. OPMERKING: De eerste 3 wasbeurten worden als radioactief beschouwd en moeten correct worden afgevoerd. De laatste 2 wasbeurten kunnen op reguliere wijze worden afgevoerd.
10. Wikkel de blot na het drogen voorzichtig in Saran-folie en exposeer deze gedurende een nacht bij kamertemperatuur aan een phosphoscreen in een stevig afgesloten cassette.
11. Analyseer de phosphoscreens met een phosphorimager en kwantificeer de radioactieve transcripten.
12. Teken een cirkel om elk radioactief signaal met OptiQuant-software. Zet de Digital Light Unit (DLU)-waarden in een grafiek om replicatiecurven te genereren.
13. Om replicatiecapaciteitsscores te genereren, werden de DLU-waarden log₁₀-getransformeerd en werden de hellingen berekend met behulp van de tijdspunten van dag 2, 4 en 6. De replicatiehellingen werden vervolgens gedeeld door de helling van WT MJ4 om replicatiecapaciteitsscores te genereren. Het is belangrijk om te normaliseren op basis van de MJ4 WT-waarden verkregen van dezelfde RT-plaat om intra-assay variabiliteit te verminderen.

Tabel 1: Recept voor de mastermix van de radiogemarkerde reverse-transcriptase-assay.
OPMERKING: Bewaren als aliquoten van 1 ml bij -20 °C.

Reagens	Volume (ml)
Nuclease-vrij H2O	419.5
Tris-Cl, pH 7.8 (1 M)	30
Kaliumchloride (1 M)	37.5
Magnesiumchloride (1 M)	2.5
Nonidet P-40 (10%)	5
EDTA (0.5 M)	1.02
Polyadenylozuur, kaliumzout (2 mg/ml)	1.25
Oligo-dT primer (25 μg/ml)	3.25
Totaal volume	500

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Reagentia voor celkweek
Amphyl reiniger/desinfectiemiddel	Fisher	22-030-394
Reservoirbakjes voor multichannel pipetten, 55 ml	Fisher	13-681-501
1 M magnesiumchloride-oplossing	Sigma-Aldrich	M1028-100ML
Reagentia voor reverse-transcriptase kwantificatie-assay
dTTP, [α-³³P]- 3000 Ci/mmol, 10 mCi/ml, 1 mCi	Perkin-Elmer	NEG605H001MC
1 M Tris-Cl, pH 8.0	Life Technologies/Invitrogen	15568025	Moet worden bijgesteld naar pH 7.8 met KOH
2 M kaliumchloride (KCl)	Life Technologies/Invitrogen	AM9640G	Aanpassen naar 1 M oplossing
0.5 M EDTA	Life Technologies/Invitrogen	15575-020
Nonidet P40	Roche	11333941103
Polyadenylozuur (Poly rA) kaliumzout	Midland Reagent Co.	P-3001
Oligo d(T) primer	Life Technologies/Invitrogen	18418-012
Dithiothreïtol (DTT)	Sigma-Aldrich	43815-1G
SR, Super Resolution Phosphor Screen, Small	Perkin-Elmer	7001485
Corning Costar Thermowell 96-well plaat model (M) Polycarbonaat	Fisher	07-200-245	Gefabriceerd door Corning Life
Corning 96-well microplaat aluminium afdichtingsband, niet steriel	Fisher	07-200-684	Gefabriceerd door Corning Life
DE-81 anionenuitwisselingspapier	Whatman	3658-915
Trinatriumcitraatdihydraat	Sigma-Aldrich	S1804-1KG
Natriumchloride	Fisher	S671-3
Autoradiografiecassette	Fisher	FB-CA-810
Cyclone bewaarscreen voor fosfor	Packard
Thermocycler, PTC-200	MJ Research