Monsterpreparatie voor luciferase-gebaseerde virale kwantificering

Samenvatting

Bron: Garcia, V., et al. High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses. J. Vis. Exp. (91), e51890, doi:10.3791/51890 (2014).

Deze video demonstreert de bereiding van celkweekmonsters om de virale load te bepalen met behulp van een luciferase-gebaseerde assay. Er wordt een overzicht gegeven van het proces van het infecteren van epitheelcellen met een genetisch gemodificeerd virus, het overbrengen van virale supernatanten en standaarden naar assay-wells, en het bevorderen van virale entry door middel van centrifugatie en incubatie. De expressie van luciferase dient als reporter, waardoor de virale concentratie kan worden gekwantificeerd op basis van de luminescente signaaloutput.

Protocol

1. Monstervoorbereiding

1. Verkrijg monsters met luciferase-expresserend virus (hier als voorbeeld VSV∆51-Fluc) voor titratie en breng deze over naar 96-well platen. Voer alternatief infecties uit in 96-well weefselkweekplaten en gebruik de supernatanten direct.
2. Laat twee kolommen onbehandeld voor de opname van standaardcurves. Voor experimenten die direct in 96-well platen worden uitgevoerd, vindt de titratie plaats aan het einde van het experiment (40 hr post-infectie), of bewaar de platen bij -80 °C en titreer op een latere datum.

2. Voorbereiding van permissieve cellen voor virustitratie

1. Bereid 24 uur vóór het titreren een suspensie van Vero-cellen voor met een concentratie van 2,5 x 10⁵ cellen/ml in Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) met 10% foetaal runderserum (FBS), 30 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethansulfonzuur (HEPES) en 1% penicilline/streptomycine. 
   OPMERKING: Hoewel in dit protocol Vero-cellen worden gebruikt, kan elke geschikte permissieve cellijn voor infectie met het vesiculaire stomatitisvirus (VSV) worden gebruikt.
2. Zaai 2,5 x 10⁴ cellen (100 μl) uit in witte 96-wells platen met een vaste platte bodem met behulp van een microplate dispenser.
   1. Bereid 12 ml cellsuspensie per plaat voor, plus 5 ml voor het doorspoelen (priming).
   2. Reinig de cassette van de microplate dispenser door de slang door te spoelen met 50 ml steriel water.
   3. Vul de lijnen van de microplate dispenser met cellsuspensie en laat 5 ml cellsuspensie doorstromen.
   4. Selecteer een programma dat 100 μl in elke well van een witte 96-wells plaat doseert. Doseer en herhaal indien nodig voor extra platen. Zaai daarnaast enkele wells uit in een transparante 96-wells plaat met platte bodem indien witte platen met een ondoorzichtige bodem worden gebruikt, om de gezondheid en dichtheid van de cellen te verifiëren.
   5. Spoel na afloop de cellen terug in de oorspronkelijke container. Reinig de cassette door 50 ml 70% ethanol en vervolgens 50 ml warm steriel water door de slang te laten stromen.
   6. Zorg ervoor dat de cassette en de slang tussen gebruikbeurten naar behoren worden gereinigd.
3. Incubeer de cellen gedurende 24 uur bij 37 °C in een bevochtigde 5% CO₂ incubator.

3. Voorbereiding van de virale standaardcurve

1. Stel een standaardcurve van VSV∆51-Fluc op in serumvrij DMEM, zodanig dat de uiteindelijke concentratie plaque-vormende eenheden (pfu) per ml na overdracht naar Vero-cellen als volgt is: 10⁸ pfu/ml, 10⁷ pfu/ml, 10⁶ pfu/ml, 10⁵ pfu/ml, 10⁴ pfu/ml, 10³ pfu/ml, 10² pfu/ml en 10¹ pfu/ml. Bereid 50 μl van elke concentratie per plaat met Vero-cellen, plus een extra 10%.
   OPMERKING: De titer van de luciferase-virusstock moet op klassieke wijze worden bepaald om een standaardcurve te genereren die absolute kwantificering mogelijk maakt. Anders kan relatieve kwantificering worden bereikt zonder nauwkeurige titerinformatie door de virustiter willekeurig vast te stellen op basis van verdunningsstappen. Bijvoorbeeld, de eerste verdunning van de standaardcurve kan worden vastgesteld op 10⁸ virale eenheden, en de volgende 1/10 verdunning op 10⁷, enzovoort. In dit kader moeten waarden worden uitgedrukt als een fold-change ten opzichte van een vooraf bepaald monster, aangezien absolute kwantificering niet nauwkeurig zal zijn.

4. Overdracht van monster-supernatanten op permissieve cellen

1. Controleer de Vero-cellen die in de 96-well plaat met transparante bodem zijn geplaatst onder een lichtmicroscoop om te bevestigen dat de monolagen voor ten minste 95% confluent zijn.
2. Breng 25 μl van het monster-supernatans over naar de Vero-cellen die in de witwandige platen zijn gezaaid. Breng geen supernatans over naar de 2 kolommen die zijn bestemd voor de standaardcurves. 
   OPMERKING: Dit kan gelijktijdig voor alle wells op een enkele plaat worden gedaan met een 96-kanaals vloeistofhandler.
3. Voeg met een 8- of 12-kanaals multichannelpipette 25 μl van elke verdunning van de standaardcurve die in stap 3 is voorbereid, toe aan de Vero-cellen in de 2 aangewezen kolommen.
4. Centrifugeer de platen 5 min bij 430 x g bij kamertemperatuur (RT).
5. Incubeer gedurende 5 hr bij 37 °C in een bevochtigde 5% CO₂ incubator.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Corning	SH30243.01
Foetaal runderserum	NorthBio Inc.	NBSF-701
Fosfaatgebufferde zoutoplossing	Corning	21-040-CV
HEPES	Fisher Scientific	BP310-1	Bereid een 1 mM oplossing voor, pH 7,3
96-wells solide witte vlakbodem polystyreen TC-behandelde microplaten	Corning	3917	384-well platen kunnen ook worden gebruikt voor een hogere doorvoer
Synergy Mx	BioTek	SMTBL	Monochromator microplaatlezer
Liquidator96	Mettler Toledo	LIQ-96-200	handmatig pipeersysteem met 96 tips
Liquidator96 LTS-tips, gesteriliseerd met filters	Mettler Toledo	LQR-200F	Alle steriel gefilterde tips die compatibel zijn met de gekozen pipetten zijn geschikt
Microflo	BioTek	111-206-21	Gebruikt om cellen uit te platen in een 96-wells plaat
Fluoroskan Ascent FL	Thermo Scientific	5210450	Microplaatfluorometer