Genereren van met lentivirus geïnfecteerde embryonale stamcellen van de muis

Samenvatting

Bron: Chiarella, A. M. et. al., Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers. J. Vis. Exp. (2018)

Deze video demonstreert de generatie van genetisch gemodificeerde embryonale stamcellen van muis met behulp van lentivirale transductie. Lentivirale deeltjes leveren een antibioticaresistentiemarker af, wat stabiele genomische integratie en selectie van getransduceerde cellen mogelijk maakt.

Protocol

1. Infectie van muizen embryonale stamcellen (mESC) met lentivirus

1. Kweek mESCs voor de chromatin in vivo assay (CiA), aangepast voor feeder-vrije condities en met een laag passagegetal (lager dan passage 35), in een basismedium van high-glucose Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM) aangevuld met 20% foetaal runderserum (FBS) van ESC-kwaliteit, 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethansulfonzuur (HEPES), 1x niet-essentiële aminozuren (NEAA), Pen/Strep, 2-mercaptoethanol en 1:500 leukemia inhibitor factor (LIF) in een incubator bij 37 °C met 5% CO₂.
   OPMERKING: De LIF wordt verkregen uit het supernatant van Lif-1C-alpha-producerende Cos-cellen (COS LIF), die in batches worden verzameld en bij -80 °C worden ingevroren.
   1. Kweek de cellen op platen die 1 - 3 h zijn gepreïncubeerd met 0,1% gelatine in 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en vervolgens zijn gewassen met 1x PBS. Voed de cellen dagelijks en splits ze elke 2 - 3 d, afhankelijk van hun dichtheid.
      OPMERKING: Morfologisch gezien moeten embryonale stamcelkolonies (ES-kolonies) klein en rond zijn en duidelijk van elkaar gescheiden.
2. Passageer de mESC naar een 12-wells plaatformaat (100.000 cellen/well) 1 d vóór de infectie.
   1. Tel de cellen met een hemocytometer. Voor cellen gekweekt in een 10-cm formaat: aspireer het oude medium, voeg 5 mL 1x PBS toe, aspireer de PBS en voeg 1 mL 0,25% trypsine toe. Incubeer de cellen in trypsine gedurende 8 min bij 37 °C, waarbij de cellen halverwege de incubatie worden geschud en getikt. Het doel van deze stap is om de cellen in een suspensie van enkelvoudige cellen te krijgen.
3. Verwijder 48 h na het verversen van het medium van de 293T menselijke embryonale niercellen (HEK) uit de 15-cm plaat het supernatant en breng dit over naar een conische buis van 50 mL.
4. Centrifugeer het supernatant bij 300 x g gedurende 5 min om celdebris te pelletteren.
5. Filter het supernatant door een 0,45-µm membraan.
   OPMERKING: Gebruik surfactant-vrije celluloseacetaatmembranen (SFCA), aangezien sommige andere materialen het virus kunnen vasthouden en de opbrengsten aanzienlijk kunnen verminderen.
6. Concentreer het virus door ultracentrifugatie met een centrifuge voorzien van een SW32-rotor, en centrifugeer dit bij 20.000 rpm (~72.000 x g) gedurende 2,5 h bij 4 °C.
7. Terwijl het virus wordt geconcentreerd via ultracentrifugatie, worden de CiA mESCs in de 12-wells plaat behandeld met vers ES-medium dat 5 µg/mL polybrene bevat.
8. Wanneer de virusconcentratie is voltooid, wordt het supernatant voorzichtig geaspireerd en wordt de viruspellet gesuspendeerd in 100 µL 1x PBS (vermijd overmatige beluchting).
9. Voeg het virus en de 1x PBS toe aan een microcentrifugebuisje van 1,5 mL. Vortex of schud het buisje bij 300 x g (of op de laagste stand) om het virus volledig te suspenderen. Centrifugeer het buisje kort in een mini-tafelcentrifuge gedurende 5 - 10 s om luchtbellen te verwijderen.
10. Voeg 30 µL van het virus toe aan elke well van een 12-wells plaat. Draai de plaat rond en centrifugeer deze vervolgens bij 1.000 x g gedurende 20 min.
    OPMERKING: De hoeveelheid toegevoegd virus kan variëren afhankelijk van de virale titer, die omgekeerd gerelateerd is aan de grootte van het afleverconstruct.
    1. Alternatief kan het virus worden flash-gefroren met vloeibare stikstof en bewaard worden bij -80 °C. Het invriezen van het virus zal echter de virale titer verlagen.
11. Plaats de 12-wells plaat terug in de incubator bij 37 °C en ververs de volgende ochtend (~16 h later) het medium met vers ES-medium.
12. Selecteer na 48 h infectie de cellen waarin het virale plasmide is geïntegreerd door het juiste antibioticum toe te voegen (bijv. 1,5 µg/mL puromycine, 10 µg/mL blasticidine, etc.). Ververs het medium dagelijks en was de cellen met 1x PBS als de meerderheid van de cellen zweeft of dood is. Houd het selectiemedium gedurende 72 - 96 h bij de cellen in een incubator bij 37 °C met 5% CO₂.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
DMEM	Corning	10-013CV
NEAA	Gibco	11140-050
HEPES (voor weefselkweek)	Corning	25-060-Cl
FBS	Atlantic Biologicals	S11550	Individuele lots getest op kwaliteit
Viruscentrifugebuisjes	Beckman Coulter	344058
Virusfiltermembraan	Corning	431220
Polybrene	Santa Cruz Biotechnology	SC134220
0,25 % Trypsine	Gibco	25200-056	met EDTA
0,05 % Trypsine	Gibco	25400-054	met EDTA
Puromycine	InvivoGen	ant-pr
Ultracentrifuge	Optima	XPN-80
SW-32 centrifugerotor	Beckman Coulter	14U4354
SW-32 Ti centrifugebakjes	Beckman Coulter	130.2
LentiX 293 menselijke embryonale niercellen	Clontech	632180
PBS	Corning	46-013-CM
CiA:Oct4 mESC	Vriendelijke gift van G. Crabtree
Lif-1C-alpha-producerende Cos-cellen	Vriendelijke gift van J. Wysocka