Identificatie van met recombinant vacciniavirus geïnfecteerde cellen middels metabole en fluorescente selectie

Samenvatting

Bron: Marzook, N. B., et al., Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins. J. Vis. Exp. (2014)

Deze video demonstreert de generatie van recombinante vacciniavirussen middels plasmide-gemedieerde homologe recombinatie in geïnfecteerde epitheelcellen. Fluorescente en metabole markers maken de selectie en identificatie mogelijk van virussen die getagde eiwitten tot expressie brengen.

Protocol

Genereren van recombinant virus

1. Overeenkomstig Figuur 1, infecteer een monolaag van BS-C-1 [Buffalo Subclone C-1 (een epitheliale niercellijn van apen afgeleid van CV-1-cellen)] cellen met vacciniavirus in serumvrij medium bij een Multiplicity of Infection (MOI) > 1.
2. 1 uur na infectie worden de cellen gered met Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) en getransfecteerd met een mengsel van recombinatievectorplasmid en transfectiereagens in een verhouding van 3:1 in serumvrij medium.
3. Schraap na 24 uur de cellen af en vang deze op in DMEM zonder foetaal runderserum (FBS), en voer drie vries-dooi-cycli uit om de cellen open te breken en de viruspartikels vrij te maken.
4. Voer een plaque-assay uit met een vloeibare overlay van 10% FBS DMEM en GPT (guaninefosforibosyltransferase (uit E. coli) selectiereagentia, mycophenolzuur (25 µg/ml), en xanthine (250 µg/ml) als volgt:
   1. Zaai een 6-wells plaat met een monocuilaag van BS-C-1-cellen.
   2. Infecteer 100% confluente cellagenen met seriële verdunningen van de gevries-ontdooide cellen die viruspartikels bevatten om een adequate scheiding van individuele plaques te waarborgen.
   3. Bedek met een vloeibare overlay van DMEM met 10% FBS, bevattende de GPT-selectiereagentia - mycophenolzuur en xanthine - bij eindconcentraties van 25 µg/ml en 250 µg/mlrespectievelijk.
5. Verwijder na een incubatie van 24 uur de vloeibare overlay en gebruik een fluorescentiemicroscoop om te zoeken naar plaques die een diffuse rode fluorescentie vertonen, wat overeenkomt met de incorporatie van mCherry uit de TDS-vector (transient dominant selection) in het virus. Afhankelijk van het doelgen en de gekozen fluorescente tag kan er in dezelfde rode plaque ook gelokaliseerde fluorescentie van het getagde gen worden waargenomen.
6. Select meerdere plaques voor elk recombinant virus door middel van lokale afschraping met een pipetpunt en 100 µl van DMEM met 5% FBS om de cellen over te brengen naar een Eppendorf-buis, gevolgd door drie vries-dooi-cycli van de afgeschraapte cellen om de recombinante virussen vrij te maken.
7. Voeg het DMEM met het ontdooide virus toe aan een monoclaag cellen in een 12-well plaat om recombinante virussen te amplificeren met GPT-selectiereagentia in het groeimedium. Schraap succesvolle amplificaties 24 uur na infectie af.
8. Voer een plaque-assay uit van succesvol geamplificeerde plaques met rode fluorescentie, ditmaal met een agarose-overlay en GPT-selectie, als volgt:
   1. Zaai een 6-wellplaat met een monolaag BS-C-1-cellen.
   2. Voer een seriële verdunning van de recombinante virussen uit en infecteer de wells met een toenemende verdunning van virussen in FBS-vrij DMEM.
   3. 1 uur na infectie wordt het vloeibare medium verwijderd en elke well bedekt met 0,5% agarose in minimal essential medium (MEM) bevattend 2,5% FBS, 292 µg/ml L-glutamine, 100 U/ml penicilline en 100 µg/ml streptomycine, samen met de GPT-selectiereagentia.
9. Select 2-3 dagen na infectie plaques die zowel rode fluorescentie als de kleur van de gekozen fluorescente tag vertonen om deze opnieuw te amplificeren, ditmaal zonder GPT-selectie.
10. Voer de volgende plaque-assay uit met een agarose-overlay zonder selectie.
11. Select plaques die hun diffuse rode fluorescentie hebben verloren, maar de gelokaliseerde fluorescentie behouden die overeenkomt met de gekozen tag.
12. Zet de plaquezuivering voort zonder selectie om een zuiver stok genotype van recombinante virussen te verkrijgen die de mCherry- en gpt-selectiegenen hebben verloren, maar de gelokaliseerde fluorescentie behouden die overeenkomt met de gekozen tag. Controleer of de stocks zuiver zijn middels een plaque-assay; alle plaques moeten een vergelijkbaar plaquefenotype vertonen.

Resultaten

Figuur 1. Overzicht van de experimentele procedure voor het creëren van een recombinant vacciniavirus. De gebeurtenissen op genetisch en cellulair niveau zijn afgebeeld, samen met representatieve plaque-afbeeldingen die de stappen schetsen na de creatie van een A3-GFP-gelabeld fluorescent vacciniavirus. (A) Cellen die geïnfecteerd zijn met vacciniavirus worden getransfecteerd met de TDS-recombinatievector. (B) In deze figuur is alleen het resultaat van linkszijdige recombinatie afgebeeld, waarbij GFP als gekozen fluorescent label is gebruikt. Rechtszijdige recombinatie zou ertoe leiden dat het gehele TDS-plasmide op soortgelijke wijze in het genoom wordt geïncorporeerd, behalve dat het label in de tussenstap, d.w.z. stap C, gefuseerd zou zijn aan het volledige doelgen. Er wordt een plaque-assay uitgevoerd op een cellaag met het recombinatiemengsel, gevolgd door GPT-selectie. (C) Plaques die zowel rode als groene fluorescentie vertonen, overeenkomend met respectievelijk mCherry- en GFP-expressie, worden gepickt en geamplificeerd. Zodra de selectie wordt opgeheven, vindt er een verlies van rode fluorescentie plaats dat overeenkomt met het verlies van de gpt- en mCherry-genen (D), waarna plaques die uitsluitend groene fluorescentie vertonen worden gepickt en geamplificeerd (E).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Mycofenolaatzuur	Sigma-Aldrich	M3536-50MG	Oplossen in 0,1 N NaOH
Xanthine	Sigma-Aldrich	X0626-5G	Oplossen in 0,1 N NaoH
FuGENE HD transfectiereagens	Promega	E2311
Fluorescentiemicroscoop uitgerust met Chroma-filters 31001, 31002	Olympus, Chroma	BX51 (Olympus); 31001, 31002 (Chroma)