Gecombineerde adenovirale transductie en siRNA-gemedieerde knockdown in kankercellen

Samenvatting

Bron: Fuchs, M. et al. Adenofection: A Method for Studying the Role of Molecular Chaperones in Cellular Morphodynamics by Depletion-Rescue Experiments. J. Vis. Exp. (2016)

Deze video demonstreert adenovirus-gemedieerde aflevering van een fluorescent transgen in combinatie met siRNA-calciumfosfaat-transfectie in cervicale kankercellen. Het adenovirus tot expressie brengt een fluorescent vervangingsprotein, terwijl het siRNA gerichte mRNA-degradatie induceert via RISC-binding. Deze sequentiële co-transfectie maakt gelijktijdige knockdown van het endogene protein en functionele rescue door het transgen mogelijk, waardoor visualisatie en bevestiging van proteinvervanging via fluorescentie-imaging mogelijk worden.

Protocol

1. Adenovirus-transductie en knockdown van endogeen eiwit door transfectie met small interfering RNA (siRNA) in HeLa-RFP-H2B-cellen met behulp van calciumfosfaat-precipitaten (CaPi)

OPMERKING: Een controle-adenovirus dat een niet-gerelateerd gen draagt (d.w.z. LacZ) of geen enkel gen, wordt gebruikt om in alle adenofecties een minimale multipliciteit van infectie (MOI) te bereiken (10-20 plaque-vormende eenheden (PFU)/cel), waarbij de laagste hoeveelheid recombinant adenovirus die het gen van interesse draagt, wordt gebruikt.

OPMERKING: Deze procedure is aangetoond effectief in het helpen normaliseren van de expressie per cel in een grote celpopulatie.

1. Tel één dag na het uitplaten van de cellen het aantal cellen in de extra uitgeplaatte schaal. Aspireer het medium en spoel één keer met 1 mL 0,05% Trypsine/ethylenediaminetetraazijnzuur (EDTA). Voeg opnieuw 1 mL 0,05% Trypsine/EDTA toe en incubeer bij 37 °C, 5% CO₂ totdat alle cellen zijn losgelaten. Scheid de cellen goed met een 1 mL pipet en tel het aantal cellen per mL met een hemocytometer.
2. Bepaal de hoeveelheid virus die nodig is om de cellen te transduceren bij een MOI van 2 PFU van het eiwit van belang (POI) per cel en 18 PFU per cel van een lege vector (bijv. LacZ), zodat er in totaal 20 PFU per cel is. Transduceer gelijktijdig 4 PFU van elk baculovirus dat GFP-getagd actine en RFP-getagd α-tubuline codeert. Transduceer de cellen volgens het volgende adenofectieprotocol.
3. Bereid in een steriele zuigkast per conditie een plastic buisje van 1,5 mL voor en voeg 400 μL verwarmd alpha minimum essential medium (αMEM) toe.
4. Ontdooi een aliquot van de virussen langzaam op ijs en verdun, indien nodig, de virusstock om een volume groter dan 1 μL te kunnen pipetteren, zodat pipetteerfouten worden geminimaliseerd.
5. Voeg de berekende virushoeveelheid per conditie toe aan elk plastic buisje van 1,5 mL met 400 μL αMEM en meng voorzichtig door te pipetteren. Plaats de virusstock onmiddellijk terug bij -80 °C om de activiteit te behouden.
6. Aspireer het medium van de cellen en pipetteer het virusmengsel voorzichtig druppelsgewijs over de cellen. Incubeer de cellen bij 37 °C, 5% CO₂ en schud de platen voorzichtig in de steriele zuigkast elke 15 min gedurende 1 uur om ervoor te zorgen dat de cellen goed bedekt zijn met het virus. Het gebruik van een kleine hoeveelheid medium vergemakkelijkt het contact van het virus met de cellen.
7. Pipetteer na incubatie voorzichtig 1,6 mL αMEM op elke plaat om een totaal volume van 2 mL te verkrijgen, start de celsynchronisatie door 2 mM thymidine toe te voegen en incubeer de cellen nogmaals 2 uur bij 37 °C, 5% CO₂.
8. Bereid ondertussen het siRNA-transfectiemengsel volgens de CaPi-transfectiemethode (zie Figuur 1). Als er geen siRNA nodig is, vervang dan de hoeveelheid siRNA door steriel water om een lege transfectie uit te voeren.
9. Bereken 200 μL mengsel per conditie, wat resulteert in 400 μL per duplicaat. Het volgende voorbeeld is gegeven voor een uiteindelijke siRNA-concentratie van 50 nM en moet worden aangepast voor elk eiwit van belang. Pipetteer in een plastic buisje van 1,5 mL 50 μL 1 M CaCl₂ en 11 μL 20 μM siRNA in 139 μL steriel H₂O en meng door te vortexen. Voeg na een korte centrifugatie voorzichtig 200 μL 2× HEPES-gebufferde zoutoplossing (HBS2x) (280 mM NaCl, 50 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethansulfonzuur (HEPES), 1,5 mM Na₂HPO₄, pH 7,01-7,05) druppelsgewijs toe.
   OPMERKING: Hoe kleiner de druppels, hoe kleiner de precipitaten, wat resulteert in een betere transfectie-efficiëntie. Meng voorzichtig drie keer door luchtinjectie met een 200 μL pipet.
10. Incubeer het mengsel 30 min bij kamertemperatuur (RT). Voeg langzaam 200 μL van het transfectiemengsel toe aan elke plaat en schud kruislings. Plaats de platen gedurende 16 uur bij 37 °C, 5% CO₂.
11. Spoel de cellen de volgende dag twee keer met 2 mL verwarmde HEPES (6,7 mM KCl, 150 mM NaCl, 10 mM HEPES, pH 7,3) en voeg 2 mL αMEM toe. Werk niet met meer dan vier celplaten tegelijk, aangezien temperatuurvariaties de lengte van de celcyclus beïnvloeden.
12. Visualiseer de infectie-efficiëntie onder een omgekeerde fluorescentiemicroscoop bij een vergroting van 20-40x (lucht) en leg ter documentatie drie representatieve beelden per conditie vast in zowel de fluorescentie- als transmissiekanalen. Voeg zeven uur later 2 mM thymidine toe en incubeer nogmaals 16 uur bij 37 °C, 5% CO₂.
13. De volgende dag, 48 uur na de siRNA-transfectie en virusinfectie, spoel je de cellen twee keer met 2 mL verwarmde fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en laat je ze 7 uur rusten in 2 mL αMEM zonder Fenolrood voor live-cell imaging of met Fenolrood voor eiwitextractie.
14. Oogst de cellen voor elke conditie 48 uur na transfectie voor de bereiding van eiwitextracten en Western blot-analyse om de efficiëntie van de knockdown en de expressie van het endogene eiwit te bepalen.
    OPMERKING: Gebruik antilichamen tegen het eiwit van belang alsook geschikte antilichamen die dienen als loading controls. De efficiëntie van de knockdown moet worden bepaald door afnemende hoeveelheden controle-celllysaten (getransfecteerd met controle-siRNA) te laden om een titratiecurve te verkrijgen (bijv. 1, ½, ¼, ⅛).

Resultaten

Figuur 1. Planning van een typisch adenofectieprotocol. De opeenvolgende stappen van een typisch experiment worden getoond voor het protocol met gebruik van CaPi-precipitaten (grijs onderstreept) of het protocol met gebruik van een kationisch lipide transfectiereagens (geel gemarkeerd), inclusief het uitplaten van cellen, transductie van adeno- en baculovirussen, transfectie van siRNA-duplexen en celsynchronisatie met een dubbele thymidineblokkade. De tijdlijnen in uren voor beide protocollen worden aan de rechterzijde van de figuur weergegeven.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
EDTA	Sigma	E5134
Foetaal rundenserum (FBS)	Thermo Fisher	12483-020
Fibronectine	Sigma	F1141
Glazen bodemschaaltjes, 35 mm	MatTek Corperation	P35G-1.5-20-C Case
HeLa-RFP-H2B	Vriendelijke gift van Dr Sabine Elowe, Québec, Canada
HEPES	Fisher Scientific	BP310-1
KCl	Fisher Scientific	BP366-500
L-Glutamine	Thermo Fisher	25030081
NaCl	Fisher Scientific	BP358-10
Minimal Essential Medium (MEM) Alpha	Wisent	310-101-CL
Minimal Essential Medium (MEM) Alpha zonder desoxyribonucleosiden/ribonucleosiden	Thermo Fisher	12000-022
Minimal Essential Medium (MEM) Alpha zonder fenolrood	Thermo Fisher	41061-029
Na₂HPO₄	Biobasic	S0404
Adenovirus custom design	Welgen	Custom design
Calciumchloride	Fisher Scientific	C79-500
CellLight® Actin-GFP, BacMam 2.0	Thermo Fisher	C10582
CellLight® Tubulin-RFP, BacMam 2.0	Thermo Fisher	C10614
siRNA-duplexen	Dharmacon	Custom design
Thymidine	Sigma	T9250
Trypsine 2,5%	Thermo Fisher	15090-046