Labeling van oppervlakte-toegankelijke cysteïneresten in gemanipuleerde virusachtige deeltjes

Samenvatting

Bron: Natilla, A.,and Hammond, R. W. Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs. J. Vis. Exp. (2013)

Deze video demonstreert locatie-specifieke fluorescente labeling van mutante virusachtige deeltjes (VLP's) geproduceerd in Nicotiana benthamiana met gebruik van een thiol-reactieve kleurstof, gevolgd door zuivering en gelelektroforese om de oppervlaktemodificatie te bevestigen.

Protocol

1. Virusinoculatie en zuivering van VLP's uit Nicotiana benthamiana-planten

1. Produce gecapte T7-RNA-transcripten uit Potato virus X (PVX)-gebaseerde vectorplasmiden die wild-type (wt) en cysteine-gemuteerde coat protein (CP)-genen van het Maize rayado fino virus (MRFV) dragen, met behulp van de T7-mMessage mMachine Kit van Ambion.
2. Inoculeer voor elke T7-transcriptiereactie twee volledig uitgebreide bladeren van N. benthamiana met 10 μL reactiemengsel en incubeer de planten gedurende 10 dagen in een kas bij 60% luchtvochtigheid, met 16 u licht (25.000-30.000 lux) bij 25 °C en 8 u donker bij 20 °C.
3. Oogst de met het virus geïnfecteerde bladeren van N. benthamiana 10 dagen na inoculatie (dpi), weeg het plantweefsel (50 gram) en plaats dit op ijs.
4. Homogeniseer het plantmateriaal in een blender in aanwezigheid van 100 mL van een gekoelde oplossing van 0,5 M Na-citraatbuffer, pH 5,5 (gebruik 2 mL buffer per gram plantweefsel).
5. Filtreer het homogenaat door 3 lagen kaasdoek en clarify door centrifugatie bij 27.000 × g gedurende 30 min. Overbreng de supernatans naar een gekoelde maatkolf, meet het volume en breng dit vervolgens over naar een gekoeld steriel bekerglas. Verwijder het pellet.
6. Verwerk de supernatans door 10% polyethyleenglycol 8.000 (PEG 8.000) toe te voegen, roer 15 min bij 4 °C en incubeer nogmaals 45 min bij 4 °C om de virus-like particles (VLP's)-PEG-matrix neer te slaan.
7. Centrifugeer het monster bij 27.000 × g gedurende 20 min bij 4 °C en verwijder de supernatans.
8. Verwerk het pellet door 8 mL 0,05 M Na-citraatbuffer, pH 5,5, te voegen dat 2% Triton X-100 bevat. Schud de centrifugebuisjes goed om het pellet los te maken. Overbreng het pellet en de buffer naar een gekoeld steriel bekerglas. Spoel de buisjes onmiddellijk met 2 mL van dezelfde buffer en voeg dit toe aan het bekerglas. Roer de suspensie bij 4 °C totdat de pellets zijn opgelost (doorgaans 1 u).
9. Clarify door centrifugatie gedurende 5 min bij 27.000 × g, verwijder het pellet en verwerk de supernatans door centrifugatie bij 140.000 × g gedurende 2 u bij 4 °C.
10. Resuspendeer het pellet in 1 mL 0,05 M Na-citraatbuffer, pH 5,5 en plaats de suspensie bovenop een 10-40% sucrosegradiënt gemaakt in 0,05 M Na-citraatbuffer, pH 5,5.
11. Centrifugeer de gradiënt gedurende 3 u bij 140.000 × g bij 4 °C.
12. Schijn met een lamp op de bovenkant van de centrifugebuis en verzamel de lichtverstrooiende bovenste band op 4 cm van de bovenkant van de buis, verdun met 0,05 M Na-citraatbuffer, pH 5,5, en centrifugeer gedurende 3 u bij 140.000 × g bij 4 °C.
13. Resuspendeer het pellet in 0,5 mL steriel water en bewaar dit bij 4 °C gedurende maximaal zes maanden.
14. Kwantificeer de VLP-concentratie door middel van een Bradford-eiwitassay. De opbrengst van VLP's ligt tussen 1 en 3 μg/g plantweefsel.

2. Fluoresceïne-5-maleïmide-labelingsreacties van VLP's

1. Bereid een 1 mM oplossing van fluoresceïne-5-maleïmide (427,37 g/mole) voor in 50 mM natriumfosfaatbuffer, pH 7,0; 1 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA). Meng met een vortex en controleer of het volledig is opgelost. Bescherm de buis tegen licht met aluminiumfolie.
2. Voeg fluoresceïne-5-maleïmide toe aan de VLPs die in stap 1 zijn geproduceerd en meng. Gebruik een 25-voudig moloverschot aan fluoresceïne-5-maleïmide ten opzichte van de molaire hoeveelheid sulfhydrylgroepen. Over het algemeen levert het gebruik van 30 μL VLPs met een concentratie van 1 μg/μL en 60 μL van de fluoresceïne-5-maleïmide-oplossing acceptabele resultaten.
3. Incubeer de reactie gedurende 2 uur bij kamertemperatuur of een nacht bij 4 °C.
4. Beëindig de reactie door dithiothreïtol (DTT) toe te voegen tot een eindconcentratie van 50 mM.
5. Verwijder niet-gereageerde fluoresceïne met een desalting spin column (Thermo Scientific Inc., Rockford IL) en centrifugatie gedurende 2 min bij 1.500 × g bij kamertemperatuur.
6. Voor analyse middels natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE), voeg 10 μL 2 × SDS-PAGE Laemmli monsterbuffer toe aan 10 μL van elke reactie. Bewaar het gelabelde eiwit lichtbeschermd bij 4 °C gedurende maximaal één maand of in eenmalige aliquoten bij -20 °C gedurende maximaal 3 maanden.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Thinwall, Ultra-Clear Tubes	Beckman	344059
mMESSAGE mMACHINE T7 Kit	Life Tecnologies	AM1344M
Fluoresceïne-5-maleïmide	Thermo Scientific Life Technologies	46130 F150	46130 is niet leverbaar, vervang door F150
Laemmli-buffer	Bio-Rad	1610737
Tris-glycine SDS (natriumdodecylsulfaat) loopbuffer	Invitrogen	LC2675
Tris-glycine transferbuffer	Invitrogen	LC3675
Nitrocellulosemembrane filterpapier sandwich	Invitrogen	LC2001
EZ-Link Maleimide-Polyethyleenglycol (PEG) 2-Biotine, No-Weigh Format	Thermo Scientific	21901