Productie van virusachtige deeltjes in gemodificeerde E. coli

Samenvatting

Bron: Chen, Z., et al. Making Conjugation-induced Fluorescent PEGylated Virus-like Particles by Dibromomaleimide-disulfide Chemistry. J. Vis. Exp. (2018)

Deze video demonstreert de methode voor de gecontroleerde expressie van het kapproteïne van bacteriofaag Qβ in gemanipuleerde E. coli. De resulterende eiwitten assembleren spontaan tot virusachtige deeltjes, die worden geoogst voor verdere bioconjugatie.

Protocol

Expressie van Qβ

1. Veeg het werkblad af met een 1:1 mengsel van bleekmiddel/ethanol.
2. Maak in een aseptische omgeving twee startculturen van 3 mL door enkele kolonies E. coli BL21(DE3) toe te voegen aan 3 mL Super Optimal Broth (SOB) medium.
3. Kweek deze gedurende de nacht op een schudmachine bij 250 rpm in een ruimte van 37 °C en 0% relatieve vochtigheid (rH).
4. Inoculeer de startcultuur in SOB-medium:
   1. Haal beide startculturen van 3 mL van de schudmachine en giet in een aseptische omgeving elke startcultuur in een van de twee gebaffelde Erlenmeyerkolven van 2 L die elk 1 L vers SOB-medium bevatten.
   2. Plaats het geïnoculeerde medium op een schudmachine bij 250 rpm in een ruimte van 37 °C en 0% rH.
5. Kweek de bacteriën op een schudmachine bij 250 rpm in een ruimte van 37 °C en 0% rH totdat de OD₆₀₀ 0,9–1,0 bereikt.
6. Voeg 1 mL van 1 M isopropyl β-D-1 thiogalactopyranoside (IPTG) toe met een P1000-pipet om de eiwitexpressie te induceren.
7. Laat het medium gedurende de nacht op de schudmachine bij 250 rpm in een ruimte van 37 °C en 0% rH staan.
8. Haal het medium de volgende ochtend van de schudmachine en centrifugeer dit in flessen van 1000 mL bij 20,621 × g gedurende 1 u bij 4 °C om de cellen te oogsten.
9. Verwijder het supernatant en verzamel de celpellet.
   1. Giet het supernatant in een kolf met ongeveer 5 mL bleekmiddel om de bacteriën te doden. Dit is afval.
   2. Gebruik een spatel om de celpellet van de bodem van de centrifugefles te schrapen en breng de pellet over in een centrifugebuis van 50 mL.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
LB-bouillon (Miller)	EMD Millipore	1.10285.0500
Tryptone, poeder	Research Products International	T60060-1000.0
Gistextract, poeder	Research Products International	Y20020-1000.0
Watervrij magnesiumsulfaat	P212121	CI-06808-1KG
Natriumchloride (Kristallijn/Gecertificeerde ACS)	Fisher Scientific	S271-10
Kaliumchloride	Fisher Scientific	BP366-500
Elga PURELAB Flex 3 waterzuiveringssysteem	Fisher Scientific	4474524
Kaliumfosfaat monobasisch	Fisher Scientific	BP362-1
Kaliumfosfaat dibasisch watervrij	Fisher Scientific	P288-500
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	Sigma Aldrich	I6758-1G
Nalgene centrifugeflessen met doppen, polypropyleencopolymeer	Thermo Scientific	3141-0250
VWR Os-500 orbitale schudmachine	VWR Scientifc Products	14005-830
P1000 Pipetman	Gilson	F123602
Falcon 50 mL conische centrifugebuis	Fisher Scientific	14-432-22