Fluorescerende functionalisering van virusachtige deeltjes via disulfide-herverbrugging

Samenvatting

Bron: Chen, Z., et al. Making Conjugation-induced Fluorescent PEGylated Virus-like Particles by Dibromomaleimide-disulfide Chemistry. J. Vis. Exp. (2018)

Deze video demonstreert de fluorescerende functionalisering van virus-achtige partikels door gereduceerde disulfiden opnieuw te overbruggen met een polyethyleenglycol (PEG)-linker, waardoor stabiele, traceerbare conjugaten ontstaan die geschikt zijn voor cellulaire beeldvorming en gerichte aflevering in biomedische toepassingen.

Protocol

1. Conjugeren van dibroommaleïmide (DB)-verbindingen op bacteriofaag Qβ

1. Reduceer disulfiden op Qβ.
   1. Los 0,0020 g tris(2-carboxyethyl)fosfine (TCEP) op in 1 mL ultrapuur water om een 100x stockoplossing te maken.
      OPMERKING: Bereid verse TCEP vóór de reductie.
   2. Voeg 200 µL Qβ (5 mg/mL) toe aan een microcentrifugebuis.
   3. Voeg vervolgens 20 µL van de 100x TCEP stockoplossing toe.
   4. Incubeer 1 u bij kamertemperatuur.
2. Herstel de brug van de gereduceerde disulfide met dibroommaleïmide polyethyleenglycol (DB-PEG).
   1. Los 0,0017 g dibroommaleïmide-polyethyleenglycol (DB-PEG) op in 100 µL DMF.
   2. Voeg 680 µL 10 mM natriumfosfaatoplossing (pH 5) toe.
   3. Voeg gereduceerde Qβ toe aan de DB-PEG-oplossing en observeer het mengproces onder een 365 nm UV- (ultraviolet) lamp. De heldergele fluorescentie is direct na het mengen zichtbaar met een handheld 365 nm UV-lamp.
   4. Laat de reactie overnacht bij kamertemperatuur (RT) verlopen op een rotisserie.
3. Zuiver het reactiemengsel drie keer met een centrifugaalfilter (molecular weight cut-off (MWCO) = 10 kDa) met gebruik van 1x PBS (fosfaatgebufferde zoutoplossing) bij 3.283 x g gedurende 20 min bij 4 °C.
4. Controleer de conjugatie via niet-reducerende SDS-PAGE (natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese) en native agarosegelelektroforese.
   OPMERKING: VLPs (virusachtige deeltjes) migreren als intacte deeltjes in een native agarosegel en worden gescheiden op basis van hun lading, grootte en vorm.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
2,3-Dibroommaleïmide 97%	Sigma Aldrich	553603-5G
Polyethyleenglycol	Alfa Aesar	41561-22
Natriumfosfaat	Fisher Scientific	AC424375000
Acrylamide/bis-acrylamide	P212121	RP-A11310-500.0
Natriumdodecylsulfaat	Sigma Aldrich	L3771-100G
Ammoniumpersulfaat	Fisher Scientific	BP179-100
Amicon Ultra-4 centrifugale filtereenheden	Millipore Sigma	UFC801024
Falcon 15 mL conische centrifugebuis	Fisher Scientific	14-959-53A
Microcentrifugebuis: 1,5 mL	Fisher Scientific	05-408-129
VWR Os-500 orbitale schudmachine	VWR Scientifc Products	14005-830
P1000 Pipetman	Gilson	F123602
P200 Pipetman	Gilson	F123601
P100 Pipetman	Gilson	F123615
P20 Pipetman	Gilson	F123600
P10 Pipetman	Gilson	F144802
Intel Weighing PM-100 klassieke laboratoriumbalans met hoge precisie	Intelligent Weighting Technology	IWT_PM100