Veilige preparatie van virale monsters voor transmissie-elektronenmicroscopie

Samenvatting

Bron: Blancett, C. D., et al. Utilization of Capsules for Negative Staining of Viral Samples within Biocontainment. J. Vis. Exp. (2017).

Deze video demonstreert de veilige preparatie van virusmonsters voor transmissie-elektronenmicroscopie. De virusdeeltjes worden gefixeerd met glutaraldehyde, gekleurd met een elektronendicht middel en onderworpen aan dampfixatie met osmiumtetroxide om structuren te stabiliseren en volledige inactivatie te waarborgen, wat een veilige hantering van virusmonsters garandeert terwijl het contrast voor hoogwaardige TEM-beeldvorming wordt verbeterd.

Protocol

1. De capsulemethode voor negatief kleuren in biocontainment met gebruik van waterige glutaaraldehyde en 1% osmiumtetroxidedamp-inactivatie

1. Aspireer 40 µL virusсусpensie in de capsule die aan een pipette is bevestigd, binnen de bio-safety cabinet (BSC) voor biocontainment.
   OPMERKING: De pipette blijft aan de capsule bevestigd totdat het proces is voltooid.
2. Plaats de pipette gedurende 10 min op zijn zij met de grids horizontaal georiënteerd. Dit is om een gelijkmatige distributie van viruspartikels op de gecoate grids te bevorderen.
3. Inactiveer het virus in de capsule binnen de BSC voor biocontainment.
   1. Pak de pipette op en druk de plunjer in om de virusoplossing in een afvalcontainer te dispenseren.
   2. Aspireer 40 µL 2% glutaaraldehyde-fixatief in de capsules. Waarschuwing: Glutaaraldehyde is een gevaarlijke chemische stof en vereist passende bescherming. Glutaaraldehyde kan gedurende korte perioden in een normale BSC worden gebruikt, maar langdurig gebruik van het open reagens vereist werken in een afzuigende BSC of een chemische zuurkast.
   3. Plaats de pipette gedurende 20 min op zijn zij. Dit is om te garanderen dat de monsters goed zijn gefixeerd.
   4. Verwijder het fixatief en aspireer 40 µL DI (gedeïoniseerd) water in de capsules om het fixatief weg te wassen. Herhaal deze wasstap voor in totaal 3 spoelcycli.
4. Aspireer 40 µL van ofwel 1% uranylacetaat (UA) of 1% kaliumfosfotungstaat (PTA) in de capsules en laat dit 30 s inwerken.
   OPMERKING: De kleuringstijd kan variëren van 10 s tot 1 min, afhankelijk van het virusmonster.
   WAARSCHUWING:: UA is een alfa-emitter en een cumulatieve toxine. Hanteer dit met passende bescherming.
5. Verwijder de capsule van de pipette en dep de grids droog door een stuk filterpapier tegen de rand van de grids te houden terwijl de grids in de capsule blijven.
6. Procedure voor inactivatie door osmiumtetroxide-damp.
   1. Plaats de capsule, met het deksel open, in een 50 mL centrifugebuis met filterpapier gedrenkt in een 1% osmiumtetroxide-oplossing. Waarschuwing: Osmiumtetroxide is extreem toxisch met een lage dampdruk. Het moet worden gebruikt in een afzuigende BSC of een chemische zuurkast. Hanteer het met passende bescherming. Plaats waarschuwingsinformatie in het werkgebied.
   2. Sluit de 50-mL centrifugebuis gedurende 1 h af om volledige permeatie van de osmiumtetroxide-damp mogelijk te maken. Decontamineer de buis vervolgens en transporteer deze vanuit het biocontainment naar de BSL-2 EM (elektronenmicroscoop)-faciliteit.
7. Verwijder de EM-grids uit de capsule.
   1. Verwijder in de BSL-2 EM-faciliteit de capsule uit de centrifugebuis en plaats deze op een pipette.
   2. Aspireer 40 µL DI-water in de capsule en dispenseer het water drie keer in een afvalcontainer.
   3. Verwijder de capsule van de pipette en dep de grids droog door met filterpapier de rand van de grids aan te raken.
   4. Bewaar de grids na luchtdrogen voor daaropvolgende TEM (transmissie-elektronenmicroscopie) beeldvorming.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Met Formvar/carbon gecoate TEM-grids	SPI	3420C-MB	200 mesh Cu Pk/100
mPrep/g capsules	EMS	85010-01	doos
mPrep/f koppelingen	EMS	85010-11	standaard 16/Pk
Glutaraldehyde	EMS	16320	50% oplossing, EM-grade
Osmiumtetroxide	EMS	19190	4% waterige oplossing
Uranylacetaat	EMS	22400	poeder
Kaliumfosfotungstate	EMS	19500	poeder
Filterpapier	Whatman	1450-090	maat 50
Transmissie-elektronenmicroscoop	JEOL	JEM-1011	TEM