Detectie van Zika-virale dsRNA-replicatie-intermediaten met behulp van immunocytochemie

Samenvatting

Bron: Contreras, D., et al. Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons. J. Vis. Exp. (2016)

De video demonstreert de detectie van Zika-virale dsRNA-intermediairen in geïnfecteerde epitheelcellen met behulp van immunocytochemie. Geïnfecteerde cellen worden gefixeerd en vervolgens geblokkeerd met een blokkeeroplossing. De primaire en secundaire antilichamen worden toegevoegd. De kernen worden gekleurd met een fluorescerende kleurstof. Het gelabelde virale dsRNA is vervolgens zichtbaar onder een fluorescentiemicroscoop.

Protocol

1. Assay voor replicatie van het Zika-virale genoom

1. Zaai naïeve Vero-cellen uit bij 1 x 10⁵ cellen per putje in volumes van 2 ml met gebruik van een 12-wellplaat. Bereid de volgende dag virale inocula (Multiplicity of Infection (MOI) van 0,01 en 0,1; 400 µl/putje) van lage en hoge titer met gebruik van serumvrij medium in triplikaat. Gebruik voor mock-infectie uitsluitend serumvrij medium (400 µl/putje).
2. Incubeer de geïnoculeerde plaat bij 37 °C met 5% CO₂ gedurende 4-6 uur. Verspreid het inoculum door de plaat elk uur voorzichtig zijwaarts te kantelen.
3. Vervang aan het einde van de incubatie het inoculum door medium aangevuld met serum (2 ml per putje).
4. Verzamel op de tijdstippen van 48 en 96 uur de monsters voor immunocytochemie (ICC).
5. Voer ICC uit met de methanol-gefixeerde cellen.
   1. Was de gefixeerde cellen drie keer met 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en blokkeer met ICC-blokkeerbuffer (3% geiten serum, 3% runderserumalbumine (BSA), 0,1% Triton-x 100 in PBS).
   2. Gebruik muis monoklonaal anti-dsRNA-antilichaam J2 (1 µg/ml) bij een verdunning van 1:100 in blokkeerbuffer en incubeer dit overnight bij 4 °C.
   3. Was de cellen met 1x PBS en voeg een secundair antilichaam, geit anti-muis IgG-594 (1 µg/ml), toe bij een verdunning van 1:1.000 in de blokkeerbuffer en incubeer dit gedurende één uur bij kamertemperatuur.
   4. Was de cellen met 1x PBS, kleur de kernen met Hoechst-kleurstof en observeer de cellen met een fluorescentiemicroscoop bij 100X vergroting (Figuur 1).

Resultaten

Figuur 1: Assays voor het evalueren van Zika-virus (ZIKV) replicatie. (A) De grafiek toont het genomische gehalte van het Zika-virus gemeten via Reverse Transcription Quantitative Polymerase Chain Reaction (RT-qPCR). Zowel de pan-genotype (ZIKV GEN) als de PRVABC59-stam (ZIKV UNI) primers vertoonden gelijke sensitiviteit en specificiteit. Zoals verwacht amplificeerden hepatitis C-virus (HCV) primers geen product. (B) De grafiek presenteert de groeikinetiek van het Zika-virus op de aangegeven tijdstippen in cellen geïnfecteerd met een laag en hoog titer vergeleken met die van de niet-geïnfecteerde mock-controle. Gemiddelde waarden en standaarddeviaties zijn weergegeven. (C) Immunocytochemie-assay voor het onderzoeken van virale replicatie. Zika-virus-geïnfecteerde cellen werden specifiek gekleurd met dsRNA-antilichamen. Op 48 hpi bevinden de geïnfecteerde cellen zich in enkele clusters, terwijl op 96 hpi de meeste cellen geïnfecteerd zijn. Hoechst-kleuring werd gebruikt voor de visualisatie van kernen (Schaalbalk = 50 µm). BF: Bright field-afbeelding.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Sigma Life Science	D5796
HEPES	Life Technologies	15630080
Glutamax	Life Technologies	35050061
Muis monoklonaal anti-dsRNA antilichaam J2	English & Scientific Consulting Kft.	10010200
Geit anti-konijn IgG Alexa Fluor 594	Life Technologies	A11020
Vero-cellijn	ATCC	CCL-81
Zika-virusstam PRVABC59	Centers for Disease Control and Prevention (CDC)
Nikon Eclipse Ti immunofluorescentiemicroscoop met Nikon Intenselight C-HGFI	Nikon	Bezoek Nikon voor aanvraag