Concentratie en zuivering van viruspartikels

Samenvatting

Bron: Fricano-Kugler, C. J., et al. Designing, Packaging, and Delivery of High Titer CRISPR Retro and Lentiviruses via Stereotaxic Injection. J. Vis. Exp. (2016).

Deze video demonstreert het stapsgewijze proces voor het concentreren en zuiveren van lentivirale deeltjes uit een gemengde suspensie die celresten van de gastheer bevat. De procedure maakt gebruik van centrifugatie, filtratie en PEG-zoutprecipitatie om virale deeltjes te isoleren en tegelijkertijd oplosbare onzuiverheden te verwijderen. Het eindproduct wordt resuspendered in een buffer en op ultralage temperaturen bewaard om de virale infectiviteit en structurele integriteit te behouden.

Protocol

1. Concentratie en zuivering van het virus

1. Maak een 5x polyethyleenglycol 6000-oplossing door 40% polyethyleenglycol 6000 en 1,5 M NaCl toe te voegen aan ddH₂O. Autoclaveer de oplossing op de vloeistofcyclus gedurende 45 min bij 121 °C. Meng de oplossing langzaam tijdens het afkoelen.
   OPMERKING: De oplossing is aanvankelijk troebel en wordt helder naarmate deze afkoelt.
2. Centrifugeer de 50 ml conische buis met beide collecties viraal supernatant bij 2.000 x g gedurende 10 min om onoplosbaar materiaal te pelletteren. Zuiver het virale medium door het te filteren via een 0,45 µm spuitfilter met lage proteïnebinding (PES of PVDF).
3. Voeg 5x polyethyleenglycol 6000-oplossing toe aan het medium (de uiteindelijke concentratie moet 8% polyethyleenglycol 6000 en 0,3 M NaCl zijn). Meng door de buis meerdere keren om te keren (niet vortexen). Incubeer de viraalhoudende polyethyleenglycol-oplossing bij 4 °C gedurende 12 uur of langer, waarbij af en toe opnieuw wordt gemengd.
4. (Dag 9) Centrifugeer de viraalhoudende polyethyleenglycol-oplossing bij 2.500 x g gedurende 45 min. Verwijder en gooi het supernatant weg en centrifugeer opnieuw gedurende 2 min. Verwijder en gooi het supernatant opnieuw weg.
5. Resuspendeer de pellet door 320 µl steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing toe te voegen (de 320 µl is 1/100ste van het oorspronkelijke volume van het verzamelde viraalhoudende medium) en incubeer dit overnight bij 4 °C. Optioneel kan de pellet worden geresuspendeerd bij kamertemperatuur op een rocker gedurende 30 min.
6. verdeel het virus na resuspensie van de pellet in aliquoten (5-10 µl per 0,5 ml buisje) en vries de aliquoten in bij -80 °C (dooi-vriescycli of opslag bij 4 °C zullen de titer drastisch verlagen).
7. Bepaal de titer van de virussen met standaardprotocollen, bijvoorbeeld door een verdunningsreeks uit te voeren op een 6-wells plaat met HEK293T-cellen en 48 uur later handmatig de fluorescerende kolonies te tellen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Lijst van transfectiereagentia
5 ml polystyreenbuisjes	Fisher Scientific	352054
polyethyleenglycol 6000 (PEG 6000)	Millipore	528877
(10x) fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS)	National Diagnostics	CL-253
0,5 ml microcentrifugebuisjes	USA Scientific	1605-0000
Matrigel	Fisher Scientific	CB-40230A