Evaluatie van een vloeibaar overlay-systeem voor virale plaque-assays

Samenvatting

Bron: Baer, A. and Kehn-Hall, K. Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems. J. Vis. Exp. (2014).

Deze video demonstreert het gebruik van een vloeibare overlay op basis van microkristallijne cellulose in een plaque-assay door de effectiviteit bij de vorming van virale plaques te vergelijken met die van een traditionele semi-solide agarose overlay.

Protocol

1. Voorbereiding van cellen en reagentia

1. Plat de dag vóór de assay geschikte gastcellen voor het betreffende virus uit (Tabel 1 en Tabel 2) tot een confluentie van 90 - 100%.
2. Bereid een fixeeroplossing van 10% formaldehyde in H₂O. Meng bijvoorbeeld 5,56 ml van een 36% formaldehyde-stockoplossing met 14,44 ml gedestilleerd H₂O (dH₂O).
   OPMERKING: Gebruik passende veiligheidsprocedures en ventilatie bij het werken met formaldehyde.
3. Bereid kristalvioletkleuring: 1% kristalviolet (CV) in 20% ethanol en dH₂O.
4. Bereid 2x plaque-medium (afhankelijk van het celtype op 2x concentratie; zie Tabel 2). Filtreer met een 0,2 µm filter indien reagentia niet steriel zijn.
5. Bereiding van immobiliserende overlays (Tabel 3)
   1. Maak voor vloeibare overlays een steriele 2,4% Avicel-oplossing in dH₂O. Om klonteren te voorkomen, voegt u het poeder toe aan een kolf met water die snel wordt gemengd met een roerstaf; giet Avicel langzaam in en roer snel bij kamertemperatuur (RT). Wanneer de oplossing te viskeus blijkt voor homogenisatie met een roerstaf, schakelt u over naar een schudkolf voor >30 min met sterke agitatie om een gelijkmatige homogenisatie te garanderen.
      OPMERKING: Stockoplossingen kunnen in lagere concentraties worden gemaakt, maar de oplossingen kunnen scheiden en moeten opnieuw worden gemengd om homogenisatie te garanderen. Werkoplossingen van Avicel kunnen worden gebruikt, variërend van 0,6-3%.
   2. Autoclaveer de oplossing na homogenisatie en bewaar deze verzegeld bij RT.
   3. Bereid voor agarose- en carboxymethylcellulose- (CMC) overlays een stockoplossing in dH₂O van 2% CMC of 0,6% agarose. Meng met een roerstaf en autoclaveer of verhit in de magnetron om de oplossing volledig op te lossen.

2. Verdunningen en infecties

1. Controle de dag na het uitplaten visueel de confluentie en levensvatbaarheid van de cellen voordat u de assay start. Bevestig dat de cellulaire morfologie standaard is en dat er een monolayer van ~90% confluentie aanwezig is.
2. Voer een tienvoudige seriële verdunning van de infectieuze monsters uit. Gebruik het cellulaire groeimedium voor virale propagatie als verdunningsmiddel (Tabel 2). Varieer het aantal benodigde verdunningen op basis van de verwachte titer van het betreffende virus, en gebruik altijd een niet-geïnfecteerd controlemonster om onafhankelijk de cellulaire levensvatbaarheid te garanderen en te helpen bij de plaque-identificatie.
3. Infecteer de cellen gedurende 45 min tot 1 uur vanuit de seriële verdunningen (Tabel 1). Gebruik een voldoende volume inoculum om de cellen te bedekken, terwijl u het volume zo laag mogelijk houdt om het virale contact met de monolayer te maximaliseren (Tabel 4). Schud de platen elke 20 min voorzichtig om een gelijkmatige bedekking te garanderen en te voorkomen dat de cellulaire monolayer uitdroogt.
4. Breng na de infectie een geschikt volume immobiliserend medium direct aan over de inocula in de well (Tabel 2) met behulp van een 1:1 mengsel van 2x plaque-medium en de immobiliserende overlay naar keuze (CMC, agarose of Avicel). Schud voorzichtig om te mengen.
   1. Voor vloeibare overlays: meng 1:1 met opgewarmd 2x plaque-medium en 1,2 - 2,4% RT stock Avicel om een werkoplossing van 0,6-1,2% Avicel overlay-medium te verkrijgen.
   2. Voor een agarose overlay: gebruik een 1:1 mengsel van opgewarmd 2x plaque-medium en een stockoplossing van verhitte 0,6% agarose; plaats dit gedurende 30 min in een waterbad van 56 °C om de temperatuur te egaliseren, waardoor een uiteindelijke agarose/overlay-concentratie van 0,3% wordt verkregen.
   3. Voor CMC: bereid een 2% stockoplossing en behandel deze zoals beschreven voor de agarose overlay.
   4. Egaliseer hete agarose of CMC altijd in water van 56 °C voordat u de overlay op de monolayer aanbrengt om beschadiging van de monolayer te voorkomen. Zorg ervoor dat de oplossing warm is, maar niet heet aanvoelt om celdood en verminderde virale titers te voorkomen. De meeste agarose overlays beginnen te stollen onder 42 °C; werk snel en/of bereid kleine hoeveelheden om stolling tijdens het hanteren te voorkomen.
5. Incubeer de platen na toevoeging van de overlay om duidelijke, telbare plaques te produceren. Plaquevorming kan 2–14 dagen duren, afhankelijk van het geanalyseerde virus (Tabel 1).
   OPMERKING: Zodra platen met een vloeibare overlay in de incubator zijn geplaatst, mogen deze niet worden verplaatst. Beweging van de vloeibare overlays tijdens de incubatieperiode zal leiden tot uitgesmeerde plaques. Agarose- en CMC-overlays zijn halfvast en kunnen periodiek worden verplaatst of gecontroleerd onder een lichtmicroscoop om de plaqueontwikkeling te monitoren.

3. Fixeren en kleuren van cellen

1. Om de cellen te fixeren, giet de Avicel-overlay af of aspireer deze, en fixeer de cellen met de 10% formaldehyde-oplossing gedurende 30 min tot overnacht (<1 ml per well voor een 6-well plaat).
   1. Voeg bij agarose of CMC de formaldehyde-oplossing direct toe aan de overlay voor 1 uur tot overnacht.
      OPMERKING: Monsters kunnen gedurende langere perioden in het fixeermiddel worden bewaard, mits dit niet verdampt en uitdroogt, aangezien dit de monocouche kan vervormen.
2. Vóór het kleuren en na de fixatie wordt de formaldehyde weggegooid en worden de halfvaste plugs voor agarose en CMC verwijderd met stromend water of handmatig met een spatel. Spoel Avicel-plaques met water om resterende overlay/fixeermiddel te verwijderen vóór het kleuren.
3. Voor het kleuren worden de cellen gedurende ~15 min bedekt met een minimale hoeveelheid kristalviolet-oplossing. Schud de platen indien nodig om een gelijkmatige dekking te garanderen.
4. Was de kristalviolet-kleuring voorzichtig af met water. Zodra de plaques zijn gefixeerd, gekleurd en gedroogd, kunnen ze onbepaald bewaard worden voor toekomstige analyse.

Tabel 1. Inoculatiecondities en celtypen voor de plaque-assay

	RVFV	VEEV	Influenza B
Celtype	Vero	Vero	MDCK
Infectieperiode	1 hr	1 hr	45 min
Incubatietijd	3 days	2 days	3 days

 

Tabel 2. Media voor plaque- en viraal/cellulair groeiproces

	RVFV	VEEV	Influenza B
Celtype	Vero	Vero	MDCK
Groeitype	DMEM1	DMEM1	DMEM2
Plaque-medium	2xEMEMA	2xEMEMA	2xEMEMB

1. Dulbecco's Modified Eagle Medium aangevuld met 10% Fetal Bovine Serum, 1% L-Glutamine, 1% Penicilline/Streptomycine.

2. Dulbecco's Modified Eagle Medium aangevuld met 1% L-Glutamine, 1% Penicilline/Streptomycine, 0,2% Bovine Serum Albumin, 0,025% HEPES, DEAE-Dextran 50ug/ml.

A. 2x Minimal Essential Media (500 ml) aangevuld met 5% FBS (25 ml), 1% essentiële aminozuren (5 ml), 1% natriumpyruvaat (5 ml), 1% L-glutamine (5 ml), 2% Pen/Strep (10 ml).

B. 2x Minimal Essential Media (500 ml) aangevuld met 0,2% Bovine Serum Albumin, 1% Minimum Essential Amino Acids (5 ml), 50ug/ml, 0,025% HEPES, DEAE-Dextran, Trypsin-TPCK*

*Voeg vlak voor de bereiding 1 µl per 25 ml van een 2 µg/ml voorraadoplossing TPCK-Trypsin toe aan het aliquot dat u zult gebruiken om te mengen met agarose voor plaques.

Tabel 3. Overlay-voorraad

	RVFV	VEEV	Influenza B
Celtype	Vero	Vero	MDCK
Infectieperiode	1 hr	1 hr	45 min
Incubatietijd	3 days	2 days	3 days

 

Tabel 4. Plaatformaten

	6 wells	12 wells	96 wells
Aantal cellen/well	5 x 105	2.5 x 105	3 x 104
Volume inoculum (μl)	400	200	50
Volume overlay (ml)	3	1.5	0.100

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Kristalviolet	Sigma Aldritch	C3886-25G
Formaldehyde-oplossing	Sigma Aldritch	F8775-500ml
Avicel RC-591 NF	FMC BioPolymer USA	RC-591 NF	Krachtig schudden bij reconstitutie gedurende >30 min om te homogeniseren
UltraPure agarose	Invitrogen	16500-100
Carboxymethylcellulose, natriumzout medium viscositeit	Sigma Aldrich	C4888