Een organotypische Slice Assay voor High-Resolution Time-Lapse Imaging van neuronale migratie in de postnatale Brain

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een organotypische slice assay geoptimaliseerd voor de postnatale hersenen en hoge-resolutie time-lapse beeldvorming van neuroblast migratie in de rostrale migratie stroom.

Samenvatting

Neurogenese in de postnatale hersenen hangt af van het onderhoud van drie biologische gebeurtenissen: proliferatie van stamcellen, migratie van neuroblasts, evenals differentiatie en integratie van nieuwe neuronen in bestaande neurale circuits. Voor de postnatale neurogenese in de olfactorische bollen, zijn deze gebeurtenissen gescheiden binnen drie anatomisch verschillende domeinen: proliferatie grotendeels komt voor in de subependymal zone (SEZ) van de laterale ventrikels, migreren neuroblasts dwars door de rostrale migratie stroom (RMS), en nieuwe neuronen differentiëren en te integreren in de olfactorische lampen (OB). De drie domeinen dienen als ideaal platform om de cellulaire, moleculaire en fysiologische mechanismen die duidelijk regelen van elk van de biologische gebeurtenissen te bestuderen. Dit artikel beschrijft een organotypische slice assay geoptimaliseerd voor postnatale hersenweefsel, waarin de extracellulaire voorwaarden nauw aan bij de na te bootsen in vivo omgeving te migreren neuroblasts. We tonen aan dat onze test voorziet in een uniforme, georiënteerd, en snelle beweging van neuroblasts binnen de RMS. Deze test zal zijn uitermate geschikt voor de studie van de cel-autonome en niet-zelfstandige regulering van de neuronale migratie door gebruik te maken van cross-transplantatie benaderingen uit de muizen op verschillende genetische achtergronden.

Protocol

I. Procedures

De volgende technieken dienen te worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden, in een laminaire stroming kap, met behulp van gesteriliseerde instrumenten.

De voorbereiding van de glazen bodem gerechten voor organotypische plakken

1. Gerechten moeten worden bereid in steriele omgeving en het gebruik van gesteriliseerd tools.
2. Een 150μL druppel slice medium (zie recepten) is geplaatst in het midden van het glas-onderste deel van de schaal met zorg om luchtbellen te voorkomen in het medium.
3. Met een wegwerpspuit is uitgerust met een 23 Gauge naald, meerdere spots van lijm (Rubber Cement - Elmer's, kat # E904) worden geplaatst op het plein rand grenzend aan de cirkelvormige dekglaasje dat het centrum van de cultuur schotel bezet, terwijl unglued de ene kant voor vloeibare uitwisseling (figuur 1). De vermelde type van lijm is niet giftig is voor de schijfjes of de cellen zoals toegepast in dit protocol. Zorg moet worden gegeven om te voorkomen dat het plaatsen van een lijm op het glas dekglas omdat dit invloed zijn op en later belemmeren beeldvorming van de plakjes. Een nucleopore membraan (diameter 25 mm, poriegrootte 8.0μm - Whatman, kat # 110614) wordt geplaatst op de top van de glazen dekglaasje, met behulp van de lijm plekken om het vast te zetten. Dit moet worden gedaan met behulp van een micro-pincet, met dien verstande dat de luchtbellen niet gevangen zitten tussen het glas dekglaasje en het membraan.
4. Voeg 1 mL plakje medium op de top van de membraan. Gerechten worden geplaatst in een incubator voor 30 minuten en daarna op ijs, totdat klaar voor gebruik.

Extractie van vroege postnatale hersenen

De beste resultaten worden verkregen wanneer plakjes worden bereid uit jonge postnatale muizen (P1-P10).

1. Pups zijn terminaal anesthesie (overdosis) door isofluorane of een andere goedgekeurde methoden. De kop kan worden besproeid met 70% ethanol tot steriliteit te verhogen, gevolgd door een snelle onthoofding met een scherpe schaar.
2. Het hoofd is gestabiliseerd door het vastklemmen van de onderkaak met micro tang. De huid is in de lengterichting uitgesneden uit de nek naar de snuit. De schedel is in de lengterichting en naar voren snijden vanaf de cisterna magna, door het maken van een mediale en twee laterale snijdt (een aan elke kant - Figuur 2A). Zorg moet worden genomen om contact met de onderliggende corticale weefsel te minimaliseren als de schedel flappen weg zijn verwijderd uit de hersenen.
3. Voor een betere stabiliteit van het weefsel tijdens het vibratome snijden, zijn de laterale-de meeste aspecten van de hersenen verwijderd door middel van twee sagittale sneden. De caudale aspect van de hersenen wordt ook verwijderd door het maken van een snede in de rostrale basis van het cerebellum (Figuur 2B).
4. De twee hersenhelften worden gescheiden door het maken van een gladde snede over de middellijn spleet, en de twee hersenhelften zijn zorgvuldig geschept uit de schedel en geplaatst, mediale oppervlak naar beneden, in een inbedding mal (afb. 2C-D).

Snijden van de gastheer hersenen

1. De twee hersenhelften in de inbedding mal worden onmiddellijk bedekt met gesmolten 3% een laag smeltpunt DNA-grade agarose gel (Fisher, cat # BP1360-100) opgelost in het prepareren van weefsels buffer die in stand wordt gehouden op 37 ° C (zie recepten). Na 2 minuten van stabilisatie op een vlak horizontaal oppervlak om zelfs het verharden van de agarose te garanderen, worden de mallen geplaatst op het ijs om de instelling te voltooien.
2. Zodra de gel met de hemisferen is ingesteld, wordt deze verwijderd uit de matrijs en bijgesneden, waardoor er 2-3mm van gel rond het hersenweefsel.
3. De gel-ingebed weefsel is vervolgens gemonteerd op het monster schijf van de vibratome, met de mediale oppervlak tot, en beveiligd met cyanoacrylaat lijm (Krazy lijm of gelijkwaardig). Zorg moet worden genomen om slechts minimale hoeveelheden lijm toe te passen, omdat te veel zal hebben toxische effecten op plakken en de migratie van cellen. Te veel lijm aan de zijkanten van het blok zal ook belemmeren het snijden, waardoor de potentiële schade in het weefsel.
4. De schijf is geïnstalleerd in de vibratome specimen tray gevuld met ijskoude weefsel voorbereiding medium.
5. Het weefsel wordt doorsnede op 150μm dik, met de vibratome snelheid in te stellen op een langzaam-aan-medium bereik (hangt af van de gebruikte vibratome, en moet dus onafhankelijk van elkaar voor een optimaal resultaat worden bepaald). In onze handen, de trillingsfrequentie is optimaal wanneer vastgesteld op maximum. De eerste paar schijfjes kunnen worden weggegooid.
6. Zodra de RMS-bevattende schijfjes worden vrijgegeven van het mes (de RMS is zichtbaar met het blote oog als een grijze U-vormige structuur zich uitstrekt van de SEZ naar de OB), worden ze zorgvuldig geplaagd uit de gel schimmel, en schepte met behulp van een kleine platte spatel. De schijfjes worden op de nucleopore membraan van de glazen bodem platen met slice medium (Figuur 3A-B). Een typische vroege postnatale hersenen van muizen levert ongeveer 2-3 RMS secties per halfrond bij het snijden op 150 um. Het is cruciaal dat de behandeling van de schijfjes is tot een minimum beperkt omdat ze erg breekbaar. De gerechten met de plakjes worden dan overgebracht naar een couveuse.

Donor hersenensnijden en RMS transplantatie

1. Donor hersenen (hersenen uiten van TL-reporters bij de migratie neuroblasts) zijn deelbaar in 250μm dikte en plakken worden verzameld in de ijskoude weefsel voorbereiding buffer.
2. Slices worden onmiddellijk onder een microscoop met dissectie epifluorescentie vermogen, en de RMS is zachtjes gemicrodissecteerde, met behulp van micro-pincet. Een pincet wordt gebruikt om de slice te stabiliseren, terwijl de andere wordt gebruikt om kleine sneetjes rond de RMS, totdat deze wordt vrijgegeven uit de slice. Het weggesneden RMS is dan in kleine explantaten (ongeveer 200 tot 500 micrometer in diameter) voorafgaand aan de transplantatie.
3. Glazen bodem platen met gastheer plakjes geplaatst op de nucleopore filters worden verwijderd uit de incubator en onder de microscoop te ontleden. Met behulp van zichtbaar licht, is de RMS duidelijk geïdentificeerd en een kleine incisie gemaakt in de eerste segment van de RMS.
4. Met behulp van een pipet is uitgerust met een 20 il tip, is een enkele donor RMS Explantatie overgebracht naar de ingesneden site in de gastheer RMS. De Explantatie wordt zachtjes geduwd in de incisie om het contact tussen de twee weefsels vast te stellen. Om ervoor te zorgen dit contact stabiel is, zijn de explantaten enigszins gedrukt tussen de slice en de nucleopore membraan.
5. Zodra alle host plakjes met de RMS worden getransplanteerd, zijn de gerechten terug naar de incubator voor ten minste 1 uur, zodat de secties om zich te vestigen op het membraan. Neuroblasts zou moeten beginnen te migreren van de explantatie in de gastheer RMS na ongeveer 1-2 uur.

Time-lapse imaging van neuronale migratie

1. De glazen bodem gerechten worden overgedragen van de incubator geïncubeerd om de kamer op de microscoop (Figuur 3C). Fluorescerende neuroblasts kunnen worden afgebeeld met een interval van 0 tot 10 minuten, afhankelijk van de aard van de analyse gewenst. We bijvoorbeeld image cytoskelet dynamiek tijdens de trek cyclus van individuele neuroblasts door onze tussenpozen van minder dan of gelijk aan 2,5 minuten. Echter, populatiedynamiek, zoals oriëntatie en de snelheid van de migratie beter gevangen met tussenpozen variërend van 5 tot 10 minuten. De keuze van de doelstellingen is zeer variabel, afhankelijk van het merk van de microscoop. Voor een Nikon C1 confocale microscoop, vinden we dat de 20x droge lens (Nikon Pan Fluor, NA 0,75, WD 0,35 mm) is het meest geschikt voor onze analyses. Voor de beste resultaten op deze confocale systeem, is de pinhole geopend om een ​​middelgrote (60μm diameter). Voor de meest geschikte trekgedrag, is beeldvorming beperkt tot cellen diep in de dikte van de RMS, ten minste 20 urn uit de buurt van een van de snijvlakken van de slice. Laser bevoegdheid moet worden geoptimaliseerd zodat het op een minimum, maar dat de details van de individuele neuroblasts zichtbaar blijven.
2. Zodra de beeldvorming is voltooid plakjes kan worden vastgesteld met ijs koud, en vers bereide 4% paraformaldehyde, immunostained, en gemonteerd op dia's voor verdere beeldvorming. Aangezien we geen jas onze membranen met alle aanhangend substraten zoals laminine, de plakjes meestal wegdrijven van het membraan zodra ze ondergedompeld in de kleuring buffers. Secties worden afgebeeld met behoud van hun 150 micrometer dikte. Het is ook mogelijk om cryopreserve en bevriezing van de plakken en een cryostaat te gebruiken om dunnere delen van de originele schijfjes te verkrijgen. Echter, zal dit resulteren in verhoging van de incidentie van artefacten in vlekken en wijziging van de integriteit van het weefsel.

II. Materialen / apparatuur

De voorbereiding van de glazen bodem gerechten voor organotypische plakken

• Kleine spuiten (1 ml)
• 23-gauge naalden
• Nucleopore Track-Etch Membraan - diameter 25mm, poriegrootte 8.0μm - Whatman, cat # 110614
• Glass Bottom Cultuur Dishes - 35mm petrischaaltje 14mm microwell, nr. 1.5 dekglaasje - MatTech, cat # P35G-1.5-14-C
• Rubber Cement - Elmer's, cat # E904
• Basale Medium Eagle - Gibco, cat # 21010
• 1M Hepes (pH 7,4)
• 1M D-glucose
• 100mm CaCl ₂
• 100mm MgSO ₄
• 1M NaHCO ₃
• dH ₂ O
• 200MM L-glutamine
• Penicilline-streptomycine

Brain-extractie en inbedding

• Verdoving (isofluorane, etc.)
• Magnetron
• Laagsmeltende Agarose - Fisher, cat # BP1360-100
• Krazy lijm - cat # KG585
• Peel-A-Way Wegwerp Embedding Molds (R-40) - 22mmx40mm rechthoekig, 20mm diep - Polysciences, cat # 18646C

Brain snijden en RMS transplantatie

• Vibratome - Leica VT1000S en alle toebehoren componenten voor slice voorbereiding
• Balanced Salt 10X Hank's oplossing - Gibco, cat # 14185
• Microdissecting pincet # 5 - Roboz, cat # RS-4976
• Microspatula - Fisher, cat # 21-401-15
• Stereomicroscoop

Time-lapse beeldvorming vanorganotypische plakken

• Vochtig Incubator, 5% CO ₂
• Omgekeerde microscoop uitgerust met een incubator kamer-en lange afstand werken doelstellingen (NA van 0,6 of hoger)

III. Recepten

Bufferoplossing voor weefsel dissectie en snijd de voorbereiding (weefsel voorbereiding buffer)

Stamoplossing	Volume	Final Concetration
10X HBSS	50 ml	1X
1M Hepes (pH 7,4)	1,25 mL	2.5mm
1M D-Glucose	15 ml	30mm
1M CaCl 2	0,5 ml	1 mM
1M MgSO 4	0,5 ml	1 mM
1M NaHCO 3	2 mL	4MM
dH 2 O	430,75 mL

Filter steriliseren met een 0,2 um filter en bewaar bij 4 ° C.

Voedingsbodem voor organotypische plakken, weefseltransplantatie en imaging (slice medium)

Stamoplossing	Volume	Uiteindelijke concentratie
Basale Medium Eagle	35 ml
Tissue voorbereiding buffer	12,9 mL
1M D-Glucose	1,35 mL	20MM
200MM L-glutamine	0,25 mL	1 mM
Penicilline-streptomycine	0,5 ml	100uds / ml penicilline en 0,1 mg / ml streptomycine

Filter steriliseren met een 0,2 um filter en bewaar bij 4 ° C.

Voorbereiding van de Low-smeltpunt agarose gel

Lage smeltpunt agarose wordt verdund in het weefsel voorbereiding buffer bij 0,3 g / ml in een 50 ml conische buis (zie recepten). De buis is de magnetron in stappen van 5-10 seconden bij high-power. Aantal stappen is afhankelijk van het totale volume, voor 10 ml, drie stappen (10-8-5 seconde, per stuk) volstaan ​​zou moeten. Het dopje is zorgvuldig losgeschroefd tussen verwarming stappen om de luchtdruk vrij te laten en explosie van de buis te voorkomen. Moet voorzichtigheid worden betracht als de buis inhoud wordt zeer heet. Nadat de agarose volledig is opgelost, wordt de buis gehandhaafd in een 37 ° C waterbad gedurende minstens 5 minuten om de temperatuur te stabiliseren alvorens te gebruiken. Langdurige blootstelling aan kamertemperatuur zal verharden van de gel. Hoewel dit moet zoveel mogelijk worden voorkomen, kan geharde gel worden opgewarmd en opnieuw gesmolten voor onmiddellijk gebruik binnen 24 uur na de eerste voorbereidingen.

Immunohistochemie op organotypische plakken

Naar aanleiding van beeldvorming op de confocale microscoop, kan plakken 's nachts worden vastgesteld op 4 ° C met 4% formaldehyde in PBS. Secties worden dan 's nachts geblokkeerd bij 4 ° C, in 10% geit serum met 1% Triton X (Sigma, Cat. # S26-36-23) in PBS gevolgd door een nacht incubatie met primaire antilichamen bij 4 ° C. Fluorescent-gemerkte geit secundaire antilichamen worden gebruikt voor visualisatie (alle verdund 1:1000, 1 uur incubatie bij kamertemperatuur). Label plakken worden grondig gewassen 5-6 keer met ijskoude PBS voorafgaand aan de montage op glas dia's en afdekken.

IV. Representatieve resultaten

Onze organotypische slice cultuur protocol is grondig getest en geoptimaliseerd over die laatste paar jaar voor de consistentie in migratiepatroon en oriëntatie. Analyse van cellen emigreren uit explantaten verkregen van muizen waarin de expressie van de rode fluorescente eiwit, Td-tomaat, wordt geïnduceerd onder de Nestin promotor (Nestin-Td tomaat), toont zeer gerichte en snelle migratie van tdTomato + neuroblasts in de gastheer RMS ( Figuur 4A). High-vergroting time-lapse analyse illustreert uitstekende resolutie van de gehele lengte van een migrerende neuroblast tijdens een 20 minuten durende sessie imaging (Figuur 4B).

Schijfjes met donor Td-tomaat + cellen werden vaste en immunostained voor de verschillende cellulaire componenten binnen de RMS. GFAP + astrocyten en CD31 + bloedvaten werden geopenbaard met behulp van fluorescerende immunohistochemie (figuur 5A). High-vergroting analyse van de plakjes gekleurd voor de cytoskeleteiwitten actine en tubuline onthullen niet-eenduidige uitstraling van deze onderdelen door een cel in het midden van migratie (figuur 5B).

Antilichamen worden gebruikt indeze voorbeelden: konijn anti-RFP (Abcam, 1:250), konijn anti-GFAP (Dako, 1:1000), rat anti-CD31 (BD Pharmigen, 1:100), muis anti-actine (Santa Cruz, een: 500), konijn anti-tubuline (Sigma, 1:1000), geit anti-muis Cy3 (Chemicon, 1:1000), geit anti-konijn AlexaFluor 647 (Invitrogen, 1:1000), geit anti-rat AlexaFluor 488 (Invitrogen , 1:1000), geit anti-konijn AlexaFluor 488 (Invitrogen, 1:1000).

Figuur 1. Voorbereiding van de glazen bodem gerechten voor organotypische plakken. Meerdere plekken van lijm worden geplaatst rond de ronde glazen bodem component van de schotel (rood), het verlaten van een zijde open voor de uitwisseling van medium van onder de filter. Een 150μL druppel slice medium is geplaatst in het midden van het glazen dekglaasje aan. Een nucleopore membraan (blauw) wordt dan toegepast, glanzende kant naar beneden, met dien verstande dat er geen luchtbellen gevangen zitten tussen het glas dekglaasje en het membraan. Een milliliter van de slice medium (grijs) is verspreid op de top van membraan en de gerechten worden geïncubeerd bij 37 ° C voor gebruik.

Figuur 2. Brain-extractie en de voorbereiding voor snijden. (A) De schedel wordt blootgesteld door incisie de hoofdhuid van de hals naar de snuit (stippellijn over de middellijn). De schedel is vervolgens overlangs gesneden en naar voren te beginnen bij de cisterna magna, door het maken van een mediale en twee laterale snijdt (een aan elke kant, 2A). (B) De laterale-de meeste aspecten van de cortex en de caudale aspect van het CZS zijn weggesneden om de stabiliteit van het weefsel te verbeteren tijdens de vibratome snijden. (CD) De twee hersenhelften worden vervolgens gescheiden en geplaatst mediale zijde naar beneden in een inbedding mal voor het aanbrengen van 3% agarose gel opgelost in het prepareren van weefsels buffer.

Figuur 3. Brain snijden en cross-transplantatie. (A) De host weefsel wordt doorsnede op 150μm dikte en de RMS-bevattende delen zijn zorgvuldig gepositioneerd plat op de nucleopore membraan van koude glazen bodem gerechten. (B) Donor hersenen (hersenen uiten van TL-verslaggevers in de RMS) doorsnede zijn op 250μm dikte, en de plakjes worden verzameld in de ijskoude weefsel voorbereiding buffer. De donor RMS is gemicrodissecteerde en snijd ze in kleine explantaten. Met behulp van een pipet is uitgerust met een 20 il tip, zijn individuele RMS explantaten overgebracht naar een ingesneden site in de gastheer RMS. (C) Na 1-2 uur incubatie, gerechten worden overgebracht naar een geïncubeerd podium op een confocale microscoop en migratie wordt gevangen genomen met behulp van time-lapse imaging. De microfoto is een representatieve lage vergroting beeld van een typische slice (grijs) zetten een uur na de transplantatie (rood explantatie van tdTomato + RMS van een donor muis; rode stippellijnen een overzicht van de RMS in de gastheer slice).

Figuur 4. Migratie van neuroblasts uit explanten in de gastheer RMS. (A) Nestin-tdTomato + neuroblasts (rood) migreren van de explantaten in de gastheer RMS (groene stippellijn) 1 uur na transplantatie. tdTomato + cellen invasie van de RMS van de gastheer organotypische plakjes bewegen in een zeer gerichte en snelle manier uit de buurt van de SEZ en de richting van de OB. (B) De trekkende cyclus kan worden waargenomen in high-power time-lapse beelden van een neuroblast gedurende ongeveer een 20 minuten tijd. Schaalbalk = 10 micrometer.

Figuur 5. Immunohistochemische evaluatie van de organotypische plakjes. Geëxplanteerd neuroblasts (rood) werden vastgesteld in het midden van de migratie 12 uur na transplantatie. (A) TL immunohistochemische kleuring van de slice onthult een dichte pool van GFAP + astrocyten (blauw) en verspreid CD31 + bloedvaten (groen) binnen de RMS van de gastheer slice. (B) Het cytoskelet van een geïsoleerde tdTomato + migrerende cel (rood) in een gastheer RMS wordt onthuld door co-immunokleuring met behulp van antilichamen tegen actine (blauw) en tubuline (groen).

Discussie

Neuronale migratie in de RMS is een essentieel onderdeel van postnatale neurogenese in de olfactorische bollen ^1. Migratie door de RMS optreedt in een raakvlak aan het oppervlak van de hersenen. Tangentiaal migreren neuroblasts zijn te onderscheiden van radiaal migrerende cellen op basis van de locatie van hun stamvader bron, evenals de uiteenlopende lot van hun laatste neuronale producten ^{1, 2, 3.} De relatief zuivere populatie van tangentiaal migrerende cellen in de postnatale RMS maakt deze anato...