Gist Colony integratiemethode

Summary

Een methode voor het inbedden gistkolonies waardoor snijden voor licht-en elektronenmicroscopie. Dit protocol maakt de bepaling van de verdeling van gesporuleerde cellen en pseudohyfale cellen in kolonies die een nieuwe tool in de richting van het begrijpen van de organisatie van de celtypen in een schimmel gemeenschap.

Abstract

Patroonvorming van de verschillende celtypes in embryo's is een belangrijk mechanisme in metazoïsche ontwikkeling. Gemeenschappen van micro-organismen, zoals de koloniën en biofilms ook weer patronen van celtypen. Bijvoorbeeld, in de gist S. cerevisiae, zijn gesporuleerde cellen en pseudohyfale cellen niet uniform verdeeld in kolonies. De functionele betekenis van patronen en de moleculaire mechanismen die deze patronen ten grondslag liggen zijn nog slecht begrepen.

Een van de uitdagingen met betrekking tot de onderzoeken van patronen van celtypen in schimmelkolonies is dat in tegenstelling tot metazoïsche weefsel, cellen in kolonies relatief zwak aan elkaar gehecht. In het bijzonder, hebben schimmelkolonies bevat niet dezelfde uitgebreide niveau van extracellulaire matrix gevonden in de meeste weefsels. Hier doen we verslag van een methode voor het inbedden en snijden gistkolonies dat het interieur patronen van celtypes openbaart in deze kolonies. De methode kan gebruikt worden om dikke secties voor te bereiden (0,5 μ) nuttig zijn voor lichtmicroscopie en dunne secties (0,1 μ) geschikt voor transmissie elektronenmicroscopie. ASCI en pseudohyfale cellen kunnen gemakkelijk te onderscheiden van eivormige gistcellen met lichtmicroscopie, terwijl het interieur structuur van deze cellen kan worden gevisualiseerd door EM.

De methode is gebaseerd op de omliggende kolonies met agar, infiltreert ze met medium Spurr, en dan snijden. Kolonies met een diameter in het bereik van 1-2 mm zijn geschikt voor dit protocol. In aanvulling op het visualiseren van het interieur van de kolonies, de methode maakt het mogelijk visualisatie van de regio van de kolonie dat de onderliggende agar binnendringt.

Protocol

1. Kolonie Isolatie en fixatie

1. Incubeer 300 kolonies op agar medium voor de aangegeven tijd (een geïsoleerde kolonie moet 1-2 mm in diameter).
2. Verwijder de kolonie (naar boven) en de onderliggende medium met behulp van een smalle spatel.
3. Plaats een paar druppels van 2% agar 42 ° C op een objectglaasje met behulp van een mL Pipetman tip en meteen plaats kolonie op agar naar boven voordat het stolt.
4. Plaats een paar druppels van 2% agar 42 ° C op kolonie en laat stollen.
5. Draag handschoenen voor alle stappen door de rest van dit protocol
6. Trim blok met scheermesje en leg ze in een 3,5 ml borosilicaat schroefdop ....

Discussion

De gepresenteerde methode toont het interieur structuren van de kolonies. Omdat de methode effectief is bij het ​​bepalen van de patronen van celtypen in een reeks van S. cerevisiae stammen met verschillende kolonie morfologie, en ook in een verwante soorten S. paradoxus ^5, de methode is ook kans om te werken op een breed scala van schimmels en andere micro-organismen.

Een kritische stap voor het succes van de methode is om ervoor te zorgen dat de gehele kolonie, waaronde.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Osmium tetroxide	Electron Microscopy Sciences	RT 19152
Silicone embedding molds	Fisher Scientific	NC 9975029
Cycloaliphatic epoxide resin	Electron Microscopy Sciences	RT 15004	ERL 4221
Epoxy resin	Electron Microscopy Sciences	RT 13000	DER 736
Nonenyl Succinic Anhydride	Electron Microscopy Sciences	RT 19050	NSA
2-Dimethyl amin–thanol	Electron Microscopy Sciences	RT 13300	DMAE
Mounting media	KPL Inc	71-00-16
Rotating wheel	Ted Pella, Inc.	Pelco 1055
Microtome	Leica Microsystems	Ultracut S