Muis blaaswand injectie is een nuttige benadering voor orthotopically studie blaas stamcellen en kanker biologie. Deze delicate microchirurgische methode kan worden beheerst met een zorgvuldige techniek en praktijk.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Muis blaaswand Injection
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Muis blaaswand injectie is een nuttige techniek om orthotopically studeren blaas verschijnselen, zoals stamcelonderzoek, glad spierweefsel, en kanker biologie. Voordat u begint met injecties, moet het operatiegebied worden gereinigd met water en zeep en antiseptische oplossing. Chirurgische apparatuur moet vóór gebruik worden gesteriliseerd en tussen elk dier. Elke muis is geplaatst onder ingeademd isofluraan anesthesie (2-5% voor inductie, 1-3% voor onderhoud) en de blaas blootgesteld door het maken van een middellijn incisie in de buik met een schaar. Als de blaas vol is, is het gedeeltelijk gedecomprimeerd door zachte knijpen tussen twee vingers. De celsuspensie van belang is intramuraal geïnjecteerd in de wand van de blaas koepel met behulp van een 29 of 30 gauge naald en een cc of kleiner spuit. De wond wordt dan gesloten met behulp van clips wond en de muis om te herstellen op een warming pad. Blaaswand injectie is een delicate microchirurgische techniek die kan worden beheerst met de praktijk.
Protocol
1. Muis blaaswand Injection
Keuze van de muis stam, leeftijd en geslacht wordt bepaald door de experimentele behoeften. We maken gebruik van muizen tussen de 8 en 12 weken oud zijn, omdat dit een venster van immunologische volwassenheid voorafgaand aan de veroudering. Als algemene richtlijn, moet muizen komen op ten minste een week voorafgaand aan de experimentele manipulatie om stress geïnduceerde verstorende factoren te vermijden.
- Reinig de chirurgische tafel oppervlak met water en zeep.
- Veeg de chirurgische tafel oppervlak met Cide gapt of antiseptische doekjes.
- Voorafgaande autoclaaf schoon chirurgische instrumenten om te gebruiken in de chirurgie.
- Daarnaast, steriliseren chirurgische instrumenten met hete kraal sterilisator onmiddellijk voorafgaand aan gebruik, maar ook tussen de dieren tijdens de operatie.
- Schone 100 ul Hamilton spuiten en 29 of 30 gauge (1 / 2 inch lang) naalden door herhaalde aspiratie en injectie met absolute alcohol voor het eerste gebruik en aan het eind van de laatste chirurgische ingreep.
- Was en Hamilton spuiten spoelen met gesteriliseerd fosfaat-gebufferde zoutoplossing tussen elk dier.
- Verdoven muizen door ze te plaatsen in een isofluraan inductie kamer, met de isofluraan ingesteld tussen 2-5%.
- Zodra algehele anesthesie is bereikt, verwijdert u de muis uit de kamer en plaats in de rugligging met een warme pad eronder voor het behoud van een normale lichaamstemperatuur.
- Bereiken onderhoud anesthesie door het plaatsen van het dier snuit in een mondstuk met verdampen isofluraan (getitreerd van 1-3% als nodig is om geschikte anesthesie te onderhouden).
- Scheer de buikhuid met tondeuse.
- Gebruik een wegwerp, steriele chirurgische laken om de anus te dekken fecale besmetting te voorkomen tijdens de operatie.
- Gebruik een seconde wegwerp, steriele chirurgische laken aan het chirurgische veld (onderbuik) te dekken.
- Prep de buik met drie stukken van Betadine doordrenkte gaas. Herhaal deze stap drie keer.
- Met behulp van een dissectiemicroscoop voor een vergroting, maak een lagere middellijn buikoperatie met een schaar.
- Expose de blaas.
- Als de blaas vol is, gedeeltelijk pak het uit door zachte neerwaartse druk op de koepel.
- Injecteer de monsteroplossing (tot 50 uL), met behulp van een 29 of 30 gauge naald en spuit, in de wand van de blaas koepel (intramuraal injectie) met de schuine rand van de naald naar boven gericht.
- Duw de zuiger van de spuit om de monsteroplossing te injecteren in de blaaswand. Een goed gelokaliseerde blaar is een indicatie van een succesvolle injectie van de cellen in de blaaswand.
- Verwijder de spuit, sluit de incisie met wond clips en laat de muis te herstellen op een warming pad.
2. Representatieve resultaten:
Een goed gelokaliseerde blaar die niet lekken en blijft stabiel in omvang is een indicatie van een succesvolle injectie van de cellen in de blaaswand (figuur 1). Histologische analyse kan worden uitgevoerd om de aanwezigheid van de geïnjecteerde cellen in de blaaswand te bevestigen.
Figuur 1. Voorbeeld van een succesvolle blaaswand injectie met Oostindische inkt ter illustratie.
Figuur 2. Schematische voorstelling van experimentele procedures.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Muis blaaswand inspuiting zorgt voor de inplanting van specifieke cellen in bepaalde delen van de blaaswand. Deze techniek heeft brede toepassingen voor muismodellen van blaaskanker, gladde spieren, en stamcel biologie. Per definitie, de muis blaaswand injectie vergemakkelijkt introductie van blaaskanker of stamcellen in een orthotope locatie, zodat hun groei en differentiatie kan worden bestudeerd in een fysiologisch relevante anatomische context. In feite, Dinney et al.. eerst beschreven deze techniek om orthotoop men...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
Wij dankbaar de steun van een Pilot subsidie van de Stanford Pediatric Research Fund en K08DK087895-01 uit de NIDDK.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Naam van het serum | Vennootschap | Catalogus nummer | |
| Isofluraan (Aerrane) | Baxter | NDC 10019-773-60 | |
| 29 of 30 gauge naalden | Hamilton | 7803-06 of 7803-07 | |
| 100 microliter spuit | Hamilton | 7656-01 |
Referenties
- Dinney, C. P., Fishbeck, R., Singh, R. K., Eve, B., Pathak, S., Brown, N., Xie, B., Fan, D., Bucana, C., Fidler, I. J., Killion, J. J. Isolation and Characterization of Metastatic Variants from Human Transitional Cell Carcinoma Passaged by Orthotopic Implantation in Athymic Nude Mice. The Journal of Urology. 154, 1532-1538 (1995).
- Singh, A. V., Franke, A. A., Blackburn, G. L., Zhou, J. Soy Phytochemicals Prevent Orthotopic Growth and Metastasis of Bladder Cancer in Mice by Alterations of Cancer Cell Proliferation and Apoptosis and Tumor Angiogenesis. Cancer Res. 66, 1851-1858 (2006).
- Yanagiuchi, A., Miyake, H., Nomi, M., Takenaka, A., Fujisawa, M. Modulation of the Microenvironment by Growth Factors Regulates the In Vivo Growth of Skeletal Myoblasts. BJU International. 103, 1569-1573 (2009).
- Miyake, H., Hara, I., Yamanaka, K., Gohji, K., Arakawa, S., Kamidono, S. Overexpression of Bcl-2 Enhances Metastatic Potential of Human Bladder Cancer Cells. British Journal of Cancer. 79, 1651-1656 (1999).
- Chancellor, M. B., Yokoyama, T., Tirney, S., Mattes, C. E., Ozawa, H., Yoshimura, N., Groat, W. C. de, Huard, J. Preliminary Results of Myoblast Injection into the Urethra and Bladder Wall: a Possible method for the Treatment of Stress Urinary Incontinence and Impaired Detrusor Contractility. Neurourol Urodyn. 19, 279-287 (2000).
- Dinney, C. P., Tanguay, S., Bucana, C. D., Eve, B. Y., Fidler, I. J. Intravesical Liposomal Muramyl Tripeptide Phosphatidylethanolamine Treatment of Human Bladder Carcinoma Growing in Nude Mice. J Interferon Cytokine Res. 15, 585-592 (1995).
- Mohamedali, K. A., Kedary, D., Sweeney, P., Kamaty, A., Davisy, D. W., Evey, B. Y., Huangy, S., Thorpez, P. E., Dinney, C. P., Rosenblum, M. G. The Vascular-targeting Fusion toxin VEGF121/rGel Inhibits the Growth of Orthotopic Human Bladder Carcinoma Tumors. Neoplasia. 7, 912-920 (2005).
- Slaton, J. W., Perrotte, P., Inoue, K., Dinney, C. P., Fidler, I. J. Interferon-α-mediated Down-Regulation of Angiogenesis-related Genes and Therapy of Bladder Cancer Are Dependent on Optimization of Biological Dose and Schedule. Clinical Cancer Research. 5, 2726-2734 (1999).
- Yokoyama, T., Huard, J., Pruchnic, R., Yoshimura, N., Qu, Z., Cao, B., De Groat, W. C., Kumon, H., Chancellor, M. B. Muscle-Derived Cell Transplantation and Differentiation into Lower Urinary Tract Smooth Muscle. Urology. 57, 826-831 (2001).
- Chan, E., Patel, A., Heston, W., Larchian, W. Mouse Orthotopic Models for Bladder Cancer Research. BJU International. 104, 1286-1291 (1988).
- Russell, P. J., Jelbart, M., Wills, E., Singh, S., Wass, J., Witherspoon, J., Raghavan, D. Establishment and characterization of a new human bladder cancer cell line showing features of squamous and glandular differentiation. Int. J. Cancer. 41, 74-74 (1988).
- Ahlering, T. E., Dubeau, L., Jones, P. A. A new in vivo model to study invasion and metastasis of human bladder carcinoma. Cancer Res. 41, 6660-6660 (1987).
- Heaney, J. A., Omellas, E. P., Daly, J. J., Lin, J. C., Rout, G. R. In vivo growth of human bladder cancer cell lines. Invest. Urol. 15, 380-380 (1978).
- Hadaschik, B., Black, P., Sea, J., Metwalli, A., Fazli, L., Dinney, C., Gleave, M., So, A. A validated mouse model for orthotopic bladder cancer using transurethral tumor inoculation and bioluminescence imaging. BJU International. 100, 1377-1384 (2007).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
