Methodenartikel

Efficiënte polyethyleenglycol (PEG) gemedieerde transformatie van de Moss Physcomitrella patens

DOI:

10.3791/2560

⸱

19 april 2011

 , 
1Department of Biology and Biotechnology, Worcester Polytechnic Institute- WPI

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een eenvoudige en efficiënte methode te transformeren Physcomitrella pantens Protoplasten is beschreven. Deze methode is een bewerking van protocollen voor Physocmitrella Protonemal protoplast en Arabidopsis Bladmoes protoplast transformatie 1.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Het maken van de Protoplasten

  1. Voeg 9 mL van 8% mannitol tot een petrischaal.
  2. Met behulp van een spatel, zet zeven dagen oud mos 2-3 PPNH4 platen van 5 - in de petrischaal met mannitol.
  3. Voeg 3 ml van 2% Driselase (Sigma D9515-25G) om de petrischaal.
  4. Incubeer de petrischaal bij kamertemperatuur onder zacht schudden gedurende 1 uur.
  5. Filter de protoplast suspensie door een 100 um mesh (BD Falcon 352.350).
  6. Spin het gefilterde suspensie bij 250 g gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant.
  7. Resuspendeer de protoplasten heel voorzichtig met 500 pl van 8% mannitol.
  8. Voeg 9,5 ml 8% mannitol in de cultuur buis. Zorg ervoor dat protoplasten zijn volledig opgehangen.
  9. Herhaal de filtratie en de resuspensie stappen (1.6, 1.7 en 1.8) nog twee keer.
  10. Neem 10 pi van de protoplast oplossing en tel de protoplasten in een hemocytometer.
  11. Vermenigvuldig het aantal protoplast in een 16 vierkant gebied met 10.000 om het aantal protoplasten per ml (zie figuur 1).

2. Transformatie

  1. Spin de protoplast suspensie bij 250 g gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant.
  2. Re-schorten protoplasten in MMG oplossing bij de concentratie van 1,6 miljoen protoplasten / ml.
  3. Incubeer de protoplast suspensie bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten.
  4. Voeg 600 ul van protoplast suspensie in een cultuur buis met 60 pg DNA. Schud de buis voorzichtig.
  5. Voeg 700 ul van PEG / Ca-oplossing in de protoplast / DNA-mengsel. Schud de buis voorzichtig tot hele mengsel homogeen is.
  6. Incubeer het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
  7. Tijdens deze wachttijd, cover PRM-B platen met cellofaan (80 mm diameter cirkels, AA Packaging Limited, Verenigd Koninkrijk), toestaan ​​cellofaan te hydrateren op de plaat oppervlakte voor ten minste 5 minuten.
  8. Met een spatel, verwijder eventuele luchtbellen gevangen tussen het cellofaan en de plaat.
  9. Verdun het mengsel met 3 ml van de W5-oplossing.
  10. Draai het mengsel bij 250 g gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant.
  11. Re-schorten protoplasten in gesmolten 2 ml van PRM-T (voordat u deze aan de protoplasten deze oplossing kan vloeistof worden bewaard bij 42 ° C). Plaat 1 mL van het opnieuw te schorten protoplasten per PRM-B plaat onder cellofaan. Wikkel de platen met Micropore (3M, Health Care). Houd de platen bij 25 ° C in een groeikamer.
  12. Als alternatief kan protoplasten opnieuw worden gesuspendeerd in 1 ml vloeistof plating medium en vergulde 0,5 ml op een PRM-B plaat bedekt met cellofaan. Hierdoor kan sneller herstel, maar het aantal regenereren planten lager is.
  13. Groeikamer is ingesteld voor een 16 uur. licht en 8 uur. donker cyclus.
  14. Verplaats het cellofaan op om een ​​nieuwe selectie plaat 4 dagen na de transformatie.

3. Representatieve resultaten:

Een voorbeeld van transformatie is weergegeven in figuur 2. Het DNA in dit voorbeeld gebruikte was een helix 7,8 kb plasmide dat een hygromycine resistent cassette. De hoeveelheid plated protoplasten werd teruggebracht tot 50% voor de fotografie. De foto's werden genomen twee weken na het planten werden verplaatst naar de selectie platen. De transformatie-efficiëntie wordt niet beïnvloed door de DNA-concentratie tot 60 microgram. Hogere concentraties van DNA zijn nadelig voor de efficiëntie van de transformatie. De gegevens bleek dat deze methode consistent resultaat over een breed scala van DNA hoeveelheden levert. Deze methode kan ook leiden tot een stabiele transformanten effectief, zoals aangegeven in tabel 1, kunnen we ongeveer 4 stabiele transformanten per microgram van het gelineariseerde DNA, dat is veel hoger dan wat eerder werd gemeld 14.

We hebben ook het effect getest van heat shock op de transformatie-efficiëntie door het transformeren van een helix plasmide dat een gen voor een fluorescerend eiwit als marker. De heat shock werd uitgevoerd 10 minuten na kamertemperatuur incubatie (in stap 2.6) door het incuberen van het mengsel in een 45 ° C waterbad gedurende 3 minuten. Het mengsel werd geïncubeerd in een water op kamertemperatuur bad onmiddellijk na heat shock voor 17 minuten. De resultaten werden opgenomen 22 uur na de transformatie. De verhoudingen van de transformanten verkregen met en zonder heat shock waren zeer vergelijkbaar (~ 25%), maar zagen we een negatief effect van heat shock op de levensvatbaarheid van de protoplasten (gegevens niet getoond).

figure-protocol-1
Figuur 1. Bekijk de protoplasten in hemocytometer. De afdeling die nodig is voor het tellen van protoplastfusie wordt aangegeven door een rood vierkant. Let op de 16 vierkantjes die nodig zijn voor het tellen van protoplasten (zie 1.11), de afbeelding toont een telling van 24 protoplasten (240.000 cellen / ml).

figure-protocol-2
Figuur 2. Foto's van 18 dagen oud voorbijgaande transformanten. Protoplasten waren transgevormd met de aangegeven hoeveelheid van de dubbele helix plasmide. A: 15μg, B: 30μg, C: 60μg; D: 120μg.

Hoeveelheid DNA (ug) Efficiëntie (tranformants / ug DNA)
15, supercoiled plasmide 120 ± 24
30, supercoiled plasmide 145 ± 54
60, supercoiled plasmide 121 ± 60
120, supercoiled plasmide 71 ± 38
60, gelineariseerde plasmide 4 ± 1

Tabel 1. Transformatie efficiëntie op verschillende DNA bedragen.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De methode hier gepresenteerde maakt een eenvoudige en consistente DNA transformatie in Physcomitrella patens protoplasten. Deze methode werd oorspronkelijk ontwikkeld voor Arabidopsis 1, maar hier hebben we aangetoond dat het goed presteert met protoplasten van Physcomitrella patens, een eenvoudiger en andere planten. Daarom kan deze methode worden toegepast op andere plantensoorten met kleine aanpassingen. Eventuele wijzigingen voor optimalisatie zijn protoplastfusie concentratie in MMG, incubatie tijd in MMG en PEG / Ca-oplossing. Kiezen we ervoor om 60 ug DNA gebruiken in onze routine experimenten, omdat het aantal transformanten lineair toeneemt met de DNA-concentratie tot dit punt (tabel 1). We konden krijgen ongeveer 7000 voorbijgaande transformanten of 200 stabiel transformanten op een enkel 60 ug DNA transformatie, die het mogelijk maakt voor verdere screening en analyse van een grote populatie van planten.

De getransformeerde protoplasten kan verspreiden met vloeibare plating medium of PRM-T worden. Hoewel de regeneratie rendement is lager als vloeibaar plating medium wordt gebruikt, kiezen we voor deze methode als de protoplasten werden getransformeerd met plasmiden dubbele helix. Zoals getoond in tabel 1, transformaties gedaan met helix plasmide DNA te genereren transformanten veel meer en dus kunnen we nog steeds grote aantallen van planten te verkrijgen met vloeibaar plating medium. Bovendien, het verspreiden van protoplasten met vloeibare plating medium kan er sneller herstel, wat belangrijk is voor experimenten met voorbijgaande fenotypes, zoals RNAi knock down experimenten 9,15. Naast de afwezigheid van de top agar zorgt voor makkelijke plant isolatie voor immunokleuring en RT-PCR 9,15.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Geen belangenconflicten verklaard.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LV wordt ondersteund door de NSF (IOS 1002837)

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Naam van het serum Bestanddeel
PPNH 4 1,84 mM KH 2 PO 4
3,4 mM Ca (NO 3) 2
1 mM MgSO 4
2,72 mM diammonium tartraat
54 uM FeSO 4 0.7 H 2 O
9,93 uM H 3 BO 3
1,97 uM MnCl 2 0.4 H 2 O
0,23 uM CoCl 2 0.6 H 2 O
0,19 uM ZnSO 4. 7H 2 O
0,22 uM CuSO 4. 5H 2 O
0,10 uM Na 2 MoO 4 .2 H 2 O
0,168 uM KI
Voeg 0,7% agar voor vaste medium.
PRM-B PPNH 4 met 6% mannitol en 0,8% agar. Voeg 10 mL 1 M CaCl2 tot 1 liter voor het storten platen.
PRM-T PPNH 4 met 6% mannitol en 0,6% agar. Voeg 0,5 mL 1 M CaCl2 tot 50 ml voor gebruik.
Vloeistof Plating Medium PPNH 4 met 8,5% mannitol zonder agar. Voeg 0,5 mL 1 M CaCl2 tot 50 ml voor gebruik.
2% Driselase Voeg 4 g van Driselase (Sigma D9515-25G) tot 200 ml van 8% mannitol. Roer zachtjes gedurende 30 minuten. bij kamertemperatuur, incubeer 30 minuten. bij 4 ° C, en zachtjes roeren gedurende 5 minuten. bij kamertemperatuur. Spin 2.500 g gedurende 10 min, gooi pellet. Filter met 0,22 micrometer, en op te slaan bevroren als 10 ml. Dooi in een kamer temperatuur waterbad voor gebruik.
MMG 0.4 M mannitol
15 mM MgCl 2
4 mM MES (pH 5,7)
PEG / Ca 4 g PEG4000
3 mL H 2 O
2,5 ml 0,8 M mannitol
1 mL 1M CaCl 2
W5 154 mM NaCl
125 mM CaCl 2
5 mM KCl
2 mM MES (pH 5,7)

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Abel, S., Theologis, T. Transient transformation of Arabidopsis leaf protoplasts: a versatile experimental system to study gene expression. Plant J. 5, 421-427 (1994).
  2. Wood, A. J., Oliver, M. J., Cove, D. J. Bryophytes as model systems. Bryologist. 103, 128-133 (2000).
  3. Schaefer, D. G., Zrÿd, J. -P. Efficient gene targeting in the moss Physcomitrella patens. Plant J. 11, 1195-1206 (1997).
  4. Schaefer, D. G. Gene targeting in Physcomitrella patens. Curr. Opin. Plant Biol. 4, 143-150 (2001).
  5. Kamisugi, Y., Cuming, A. C., Cove, D. J. Parameters determining the efficiency of gene targeting in the moss Physcomitrella patens. Nucleic Acids Res. 33, e173-e173 (2005).
  6. Cove, D. The moss Physcomitrella patens. Annu. Rev. Genet. 39, 339-358 (2005).
  7. Kamisugi, Y. The mechanism of gene targeting in Physcomitrella patens: homologous recombination, concatenation and multiple integration. Nucleic Acids Res. 34, 6205-6215 (2006).
  8. Vidali, L. Rapid formin-mediated actin-filament elongation is essential for polarized plant cell growth. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2009).
  9. Sawahel, W. Transfer of foreign DNA into Physcomitrella protonemal tissue by using the gene gun. Plant Mol. Biol. 10, 315-316 (1992).
  10. Schaefer, D. Stable transformation of the moss Physcomitrella patens. Mol. Gen. Genet. 226, 418-424 (1991).
  11. Cho, S. H. Particle bombardment mediated transformation and GFP expression in the moss Physcomitrella patens. Mol. Cells. 9, 14-19 (1999).
  12. Ashton, N. W. The bryophyte Physcomitrella patens replicates extrachromosomal transgenic elements. New Phytol. 146, 391-402 (2000).
  13. Hohe, A. An improved and highly standardized transformation procedure allows efficient production of single and multiple targeted gene-knockouts in a moss, Physcomitrella patens. Curr. Genet. 44, 339-347 (2004).
  14. Vidali, L. Profilin is essential for tip growth in the moss Physcomitrella patens. Plant Cell. 19, 3705-3722 (2007).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Isolatie van protoplastentransformatie van mossenfluorescentiemicroscopieDNA opnamecellofaanoverlaymannitolwasbeurtDrizly digestietransi nte transformantengene targeting

Gerelateerde artikelen