Het beoordelen van Gravende, Nest Bouw en Hamsteren in Muizen

Samenvatting

Gravende, nesten en hamsteren zijn soorten die typisch activiteiten die muizen gemakkelijk uit te voeren in het laboratorium. Dit artikel beschrijft hoe ze kunnen gemakkelijk en goedkoop worden beoordeeld. Deze protocollen zijn extreem gevoelig voor muizenstam, hersenletsel en ziekten. Bovendien vormen zij "milieuverrijking" voor de muizen, en belichamen de "Verfijning" aspect van de "3 V's" 18.

Samenvatting

Verslechtering van de mogelijkheid om "activiteiten van het dagelijks leven '(ADL) uit te voeren is een vroeg teken van de ziekte van Alzheimer (AD). Preklinische gedrag screening van mogelijke behandelingen voor AD op dit moment vooral gericht op de cognitieve testen, die vaak vereist dure apparatuur en veel van de experimentator tijd. Echter, het menselijk episodisch geheugen (de zwaarst getroffen aspect van het geheugen in het AD) is anders dan knaagdieren geheugen, dat lijkt te zijn overwegend niet-episodische. Daarom is de huidige manier van screenen voor nieuwe AD behandelingen voor AD bij knaagdieren zijn intrinsiek weinig kans van slagen. Een nieuwe benadering van de preklinische screening zou zijn om de ADL van muizen te karakteriseren. Toevallig zijn er meerdere van dergelijke testen onlangs ontwikkeld in Oxford, en hier de drie meest gevoelige en goed gekarakteriseerd worden gepresenteerd.

Gravende werd voor het eerst ontwikkeld in Oxford ^13. Het evolueerde van een behoefte om een ​​muis hamsteren paradigma te ontwikkelen. De meeste publicerened knaagdier hamsteren paradigma's nodig een verre bron van voedsel te worden gekoppeld aan de kooi van een verbindingsgang. Dit zou betekenen dat het wijzigen van de kooi en het maken van een muis-proof verbindingsgang en voedsel bron. Dus het was onderzocht of het mogelijk zou zijn om het voedsel bron zetten in de kooi. Het bleek dat als een container werd geplaatst op de vloer werd geleegd door de volgende ochtend., Waren Het eten pellets, echter gewoon gestort op een hoop bij de container ingang, in plaats van in een discrete plaats uit de buurt van de container, zoals te verwachten wanneer de muizen waren echt hamsteren hen. Nadere inspectie bleek dat de muizen werden graven uitvoeren ("gravende") bewegingen, niet dragen van de pellets in hun mond om een geselecteerde plaats als ze zou doen als echt hamsteren ze. ⁶

Voedsel pellets zijn geen essentieel substraat voor gravende, muizen zullen lege tubes gevuld met zand, grind, zelfs vieze bodembedekking uit hun eigen kooi. Meervoorbij is, zal ze leeg een volle tube, zelfs als een lege men naast het ⁸ geplaatst.

Verschillende nesten protocollen bestaan ​​in de literatuur. De huidige Oxford een vereenvoudiging van de procedure en heeft een goed gedefinieerde scoresysteem voor de kwaliteit nest ^5.

Een hamsteren paradigma werd later ontwikkeld waarin de muizen, in plaats van oppotten terug naar de echte kooi, werden aangepast aan het leven in de "thuisbasis" van een apparaat hamsteren. Deze thuisbasis was verbonden met een buis van draadgaas, het distale uiteinde van die bevatte de bron van voedsel. Deze regeling bleek een goede hamsteren gedrag, zolang de muizen werden aangepast aan het leven in de "thuisbasis" gedurende de dag en alleen toegestaan ​​om het hamsteren buis gaan 's nachts rendement.

Protocol

1. Gravende

1. Apparaat

Verschillende container ontwerpen werden uitgeprobeerd (bijvoorbeeld een metalen kruik die gemakkelijk kunnen worden gereinigd, maar muizen waren terughoudend om het in te voeren). Uiteindelijk werd ontdekt dat een lengte van plastic downpipe (als aangesloten op goten op huizen) licht verhoogd aan de ene kant om onbedoelde (niet-opzettelijke) verplaatsing van voedsel pellets te voorkomen en verzegeld aan de andere kant, was een efficiënte stuk van apparatuur. Holen worden nu gemaakt van plastic downpipe, 68 mm diameter, gesneden in 20 cm lange lengtes (figuur 1). Het ene uiteinde is afgesloten met een stop van 12 mm medium density vezelplaat (MDF). (Bescherming van de ademhalingswegen is geboden bij het werken met mdf). Voor het reinigen doeleinden en waterdicht maken, kan een waterdichte lijm mastiek verbinding worden toegepast op de binnen-en buitenkant van de mdf en dienen te lijmen het in de gravende buis. Machine schroeven (5 cm lang) worden gebruikt om de andere kant o verheffenf de buis 3 cm van de vloer. Twee gaten zijn geboord 1 cm van het open uiteinde van de gravende buis onder een hoek van 90 ° en de schroeven geplaatst en aangedraaid ^4.

De diameter van de holen is waarschijnlijk cruciaal belang; Schmid-Holmes et al. ¹⁹ waargenomen dat muizen in het wild "hol schoongemaakt" voornamelijk uit holen vergelijkbaar in grootte met onze kunstmatige degenen..

Figuur 1. Een muis in een gravende buis.

2. Procedure

1. Gewenning
   Gravende is normaal gesproken spontaan, maar er is een zekere leerelement. Het leerproces wordt versterkt door sociale facilitatie. Daarom plaats een volledig hol 's nachts in de groep kooi van muizen die later moeten worden getest met een behandeling. Elke hol is gevuld met 200 g van het voedsel pellets normaal gesproken geleverd als dieet. (Dit verwijst naar tHij dichte gecomprimeerde vorm van voeding, als een "uitgebreid" dieet in gebruik is het hol zal houden minder dan 200g). Onderzoekers moeten rekening houden met deze factoren bij het selecteren van een gravende substraat.
   
   Als de muizen op voedsel rantsoeneren (bijvoorbeeld om hen motiveren om een ​​gelijktijdige doolhof leertaak run) non-food stoffen kunnen worden gebruikt, bijvoorbeeld klei ballen, zoals gebruikt om het oppervlak van de bodem in binnen plantenpotten lijn; erwt grind (steentjes ~ 1 cm diameter) en zand. Pea grind en zand, die drie keer zwaarder is dan voedsel pellets, zijn bruikbaar substituut voor voedsel pellets als de muizen zijn zeer krachtig gravende, op een "plafond effect" te vermijden.
2. Baselining
   Run (bij voorkeur twee) baseline gravende test 48 uur uit elkaar op dezelfde manier als zal worden gedaan voor het testen van na de voorgestelde behandeling. De test is optimaal begon rond zestien als de muizen zijn gehuisvest op een 0700 tot 1900 uur donker-licht cyclus. Dit is een gevoelige tijdte testen, aangezien ze normaal gesproken niet wakker op dit moment en gravende gaat langzamer dan wanneer ze waren goed in de donkere fase en daardoor zeer actief. Twee uur na de start, is een "snapshot" meting gehouden met het gewicht van voedsel boorde, het hol wordt geleegd in een getarreerd container en gewogen en de pellets vervangen in het hol die weer in de kooi. Als de muis in het hol, maar voorzichtig giet het en de inhoud in de weeg-container en vervang de muis in de kooi. Het gewicht ingegraven op twee uur wordt vervolgens berekend door aftrekken van de oorspronkelijke 200 g. De laatste lezing wordt genomen de volgende ochtend. Timing is niet kritisch omdat de muizen terug zijn gegaan om te slapen (vaak in het hol) en zijn niet langer actief gravende. Gebruik de 2 h meting genomen op de tweede proef voor groepen uitgebalanceerd voor aanvang een performance te vormen. Als gravende neemt toe met de praktijk ^17, baselining helpt ook de muizen te bereiken meer stabiele asympTotic prestatie die de behandeling effecten laat zien beter.
3. Testen
   Voor het testen, zijn na behandelingen die de muizen zijn gezien de gravende-test precies hetzelfde als in de baselining podium. Als de gravende test is om chronisch worden gebruikt, wordt aanbevolen dat ten minste 48 uur scheiden de tests tot een daling van de prestaties als gevolg van overmatige blootstelling aan de procedure te voorkomen.
4. Noot
   Geen vervanging van de ingegraven voedsel op de kooi vloer in het hol. Zelfs als de muis niet heeft ingegraven iets, voert u de wegen procedure als u zou doen als gravende had plaatsgevonden, de verstoring door weging heeft de neiging om gedrag te stimuleren, en muizen die al boorde een aantal van de ondergrond zal vaak beginnen graven met vernieuwde kracht na de weegproces.

2. Verwachte resultaten

C57 ~ BL / 6 muizen meestal hol ongeveer 70 g in de eerste twee uur, en in de buurt 200 g's nachts. Hippocampus gelaedeerde muizen vaak hol minder dan 5 g ¹¹ (figuur 2). Prionziekte remt gravende ^1,2, net als lipopolysaccharide administratie ^20. Gravende kan detecteren prion (scrapie) ziekte bij 10-12 weken na de injectie van zieke hersenhomogenaat, terwijl klinische symptomen alleen verschijnen op 22 weken ^13. (Figuur 3). Gravende is aangetoond dat het gevoelig zijn voor verschillen ¹⁵ en knock-out van kalium ion-kanaal subeenheden ¹⁰ stam.

Figuur 2. Gewicht van voedsel pellets (medianen en interkwartielafstand series) ingegraven in twee uur met de controle en hippocampus-gelaedeerde muizen. De laatste ingegraven aanzienlijk minder dan controles (P = 0,0001).

Figuur 3. Gewicht vanfood pellets (middelen) 's nachts ingegraven door de controle en scrapie-geïnfecteerde muizen. Gravende toe (met de praktijk) in beide groepen van week 7 tot 10 na de injectie, maar vanaf week 12 ingraving dalingen in de scrapie-groep en het verschil tussen de groepen wordt statistisch significant (meer dan twee standaard afwijkingen van het gemiddelde).

3. Discussie

We hebben getest wroeten in andere soorten knaagdieren - ratten, gerbils, hamsters en Egyptische stekelige muizen ^8. Alle maar deze laatste kon worden aangezet hol aanzienlijke hoeveelheden van aardse substraten, zoals grind of zand, maar gravende van voedsel pellets was veel minder, zelfs na een uitgebreide ervaring met de aardse materialen. De reden voor dit verschil van muizen is niet bekend. Nadat dit werk was gedaan, werd ontdekt dat de Egyptische stekelige muizen in feite niet te maken holen in het wild, ze kunnen bezetten holen die door gerbils ook, de oppervlakte van hun natuurlijke habitat is vaak hard rock. Recente waarnemingen in Nairobi bleek dat, binnen het geslacht Acomys, ook Wilson's stekelige muis (Acomys wilsoni) en Percival's stekelige muis (Acomys percivali), die hol doen in het wild, ingegraven in het laboratorium.

4. Nesting

1. Apparaat

Deze test wordt uitgevoerd in individuele kooien, dezelfde als die gebruikt worden voor burrowing geschikt. Normaal strooisel moet betrekking hebben op de vloer tot een diepte van 0,5 cm. (Variatie in diepte, en zeer diep beddengoed, kunnen nest bouw beïnvloeden). Elke kooi is voorzien van een "Nestlet", een 5 cm in het vierkant van geperst katoen slaan (Ancare).

2. Procedure

Muizen zijn individueel geplaatst in de nesten kooien ongeveer een uur voor de donkere fase, en de resultaten worden beoordeeld de volgende ochtend. Net als bij gravende, en om dezelfde redenen, de timing is niet kritisch.

3.Scoren

De nesten worden beoordeeld op een 5-punts schaal (figuren 4-8), en de hoeveelheid untorn Nestlet is ook gewogen ^5.

1. De Nestlet is grotendeels onaangetast (> 90% intact).
2. De Nestlet is gedeeltelijk verscheurd (50-90% blijft intact).
3. De Nestlet is meestal versnipperd, maar vaak is er geen aanwijsbaar nest site: <50% van de Nestlet blijft intact, maar <90% is in een kwart van de kooi vloeroppervlak, dat wil zeggen de katoen is niet verzameld in een nest, maar verspreid over de kooi . Let op: het materiaal kan soms in een ruim gedefinieerde nest gebied, maar de kritische definitie is dat 50-90% is versnipperd is.
4. Een herkenbare, maar plat nest:> 90% van de Nestlet is verscheurd, wordt het materiaal verzameld in een nest in een kwart van de kooi vloeroppervlak, maar het nest is vlak, met muren hoger dan de muis lichaamslengte (opgerold op de zijkant) op minder dan 50% van de omtrek.
5. Een (bijna) perfect nest:> 90% van de Nestlet is verscheurd, het nest is een krater, met muren hoger dan de muis lichaamslengte op meer dan 50% van de omtrek.

Wanneer criteria niet eens het verschil dan delen. Bijvoorbeeld: een perfecte nest met een unshredded 0.7g stuk zou scoren 4,5.

Figuur 4. Nest score 1

Figuur 5. Nest score 2

Figuur 6. Nest score 3

Figuur 7. Nest score 4

Figuur 8. Nest score 5

4. Verwachte resultaten

Zowel mannen als vrouwen te maken nesten, want hun doel is thermoregulatie maar ook als geassocieerd met de voortplanting. Voor C57BL / 6 muizen, nest scores voor mannen en vrouwen zijn in hetzelfde bereik, al hebben we niet gedaan een gecontroleerde vergelijking in een enkel experiment. De meeste C57BL / 6 muizen score 4-5 op nest bouwen, maar als de hippocampus is gelaedeerde de mediaan score zou rond 1-2; een score van 3 is waarschijnlijk niet worden overschreden (Figuur 9). Nesting bleek ook gevoelig voor prionziekte rond de 10-12 weken ^1,2,16.

Figuur 9. Nest scores (mediaan en interkwartielafstand reeksen) voor controle muizen en muizen met laesies van het dorsale, ventrale en complete hippocampus. Alleen de volledige gelaedeerde muizen remming van de nesten zien, zodat de effecten van selectieve dorsale en ventrAl regio's lijken sub-drempel, maar additief.

5. Hamsteren

1. Apparaat

Een reeks van "thuisbases" zijn verbonden met buizen gemaakt van gaas, verzegeld permanent aan het distale uiteinde waar het voedsel pellets worden geplaatst en tijdelijk aan het proximale uiteinde door een houten plug. Dit wordt gebruikt om de muizen het invoeren van de buizen voor aanpassing aan de thuisbasis heeft occurred7 te voorkomen.

Het apparaat (figuur 10) kan worden gemaakt op verschillende manieren, zolang de basisprincipes worden nageleefd. Onze bestaat uit een rij van 8 houten kisten, elk 30 x 13 x 15 cm met transparante plexiglas deksels. Elk wordt geleverd met een fles water, en heeft een gat in de rug waarin het hamsteren buis is voorzien van push-. Buizen zijn gemaakt van zwart plastic, 10 cm lang, 40 mm diameter, verbonden met een gaas buis, 45 cm lang, 4 cm diameter, met een totale lengte van 50 cm vormen. Het gaas bestaat uit 13 mm pleinen,en is een dubbele rol met de mazen verkeerde afgestemd op de gaten in het gaas kleinere en voedsel pellets te laten vallen door te voorkomen. Als 6 mm vierkante mazen is beschikbaar Dit is een beter materiaal als een broodje voldoende zou zijn. Het distale uiteinde van de buis, waar het voedsel pellets worden geplaatst, is gesloten. Het proximale uiteinde is afgesloten met een verwijderbare houten plug.

Figuur 10. Muizen in het hamsteren buizen

2. Procedure

1. Typisch, hamsteren is zeer variabel de eerste keer en een aantal muizen kunnen niet hamsteren helemaal. Hamsteren, net als gravende, verbetert met de praktijk. Daarom, waar experimenteel ontwerp maakt, worden baselining sessies best gegeven voordat een behandeling wordt toegediend. Het is duidelijk, dit is niet handig als de onafhankelijke variabele is aangeboren, zoals bij een (niet-voorwaardelijke) mutant muis of bij het testen van verschillende muizenstammen.
2. Een muis wordt inelk vak in het begin van de dag te wennen aan. De doos is voorzien van een kartonnen tunnel die in de echte groep kooi gedurende ten minste een nacht, ook een flinke portie vieze bodembedekking, zodat het gevoel dat "thuis". De toegang tot het hamsteren buis voorkomen totdat 's avonds met een houten stop. 100 g voedsel pellets (een mengsel van kleine en grote) wordt geplaatst aan het distale uiteinde van het hamsteren buis (door gieten ze in aan de andere kant met de buis in een verticale positie). Om ervoor te zorgen dat de muis is licht hongerig voor het testen begint, is de thuisbasis doos niet voorzien van voedsel.
3. Vlak voor de start van de donkere fase, wordt de houten stop om de muis toegang tot het hamsteren buis mogelijk te maken. De volgende ochtend (nogmaals, de timing is niet kritisch) te verzamelen en wegen al het eten pellets die zijn opgepot in de thuisbasis box.

6. Verwachte resultaten

Met behulp van vrouwelijke C57BL / 6 muizen, zou het opgepot mediaan bedrag rond50-70 g. Hippocampus letsels sterk onderdrukken hoarding11, terwijl de prefrontale cortex letsels slechts een zwak effect ¹² (figuur 11).

Figuur 11. Gewicht van voedsel pellets opgepot door de controle en de mediale prefrontale cortex-gelaedeerde muizen (medianen en interkwartielafstand bereiken). Hoewel de medianen verschillen aanzienlijk, de grote variatie in de besturing: het resultaat is verre van statistisch significant (p = 0.3).

Discussie

Deze tests zijn zeer eenvoudig uit te voeren, maar de effecten zijn zeer groot, waardoor ze zeer gevoelig zijn voor behandelingen, stam verschillen, enz. Ze voldoen aan de "Verfijning" aspect van Russell en Burch's 3 R's ^"18. Inderdaad, goede prestaties op tests, zoals gravende lijkt te duiden op een goede algemene gezondheid bij dieren. Dus dit zou een goede test voor de beoordeling van het welzijn van dieren te zijn.

Het belang van milieu-verrijking voor laboratorium-knaagdieren is goed herkend deze dagen. Verstrekking van nestmateriaal is nu standaard praktijk in veel stallen, en dit is makkelijk te doen. Het enthousiasme waarmee de muizen hol maakt gravende een potentieel uitstekende verrijking, maar helaas een "self-herladen" hol zou een praktische manier van het verstrekken van deze is nog niet ontwikkeld zijn. Of het nu muizen vinden hamsteren verrijkend is nog niet vastgesteld.

_content "> Een nadeel is dat de gegevens die zijn gegenereerd door deze tests over het algemeen is het non-parametrische (niet Gauss in distributie), zodat geschikte niet-parametrische statistieken noodzakelijk zijn om ze te analyseren, zoals de Mann-Whitney U test voor paarsgewijze vergelijkingen, Kruskal- Wallis ANOVA voor multi-group data. Indien herhaalde metingen ontwerpen worden gebruikt, omdat er geen geschikte ANOVA test voor non-parametrische data, kunnen de resultaten worden omgezet, bijvoorbeeld door vierkantswortel of log procedures om ze te laten voldoen aan een meer normale verdeling .

De metingen van het apparaat kan iets afwijken van die welke in de tekst (handig voor de VS onderzoekers), maar grote verschillen moeten worden vermeden. Echter, in sommige gevallen andere onderzoekers kunnen vinden verschillende constructies beter werken dan de hier beschreven.

Zoals voor alle gedrags-metingen, moet de muizen worden getest om te zien of hun activiteit normaal zijn, zoals inactiviteit uiteraard zal een detrim hebbenouderlijke invloed op soortspecifieke gedrag. Bij het scrapie-geïnfecteerde muizen werden aangetast gravende en nesting tonen, hun activiteit normaal waren (getest in een open veld toestellen). Inderdaad, een periode van hyperactiviteit komt rond 2-4 weken na deze soorten-typische gedragingen het eerst worden ^twee aangetast.

De sterke waardevermindering die door de hippocampus laesies op gravende, nesting en oppotten, die allemaal soorten die typisch gedrag, een aanvulling op de bijzondere waardeverminderingen in de ruimtelijke leren en memory9 die zulke gerenommeerde effecten van deze laesies. Ze lijken gelijkwaardig te zijn aan de beperkingen in de activiteiten van het dagelijks leven zo kenmerkend is voor AD ^14.

Deze soorten-typische tests kan heel goed blijken te zijn van groot nut in preklinische screening voor behandelingen voor de ziekte van Alzheimer en andere neurodegeneratieve ziekten ^14. In veel menselijke hersenaandoeningen een verlies of verminderd vermogen tot normale avond uit te voerenryday taken is net zo belangrijk als andere kenmerken van de ziekte, zoals cognitieve stoornissen. In het bijzonder kan dit verlies noodzakelijk betrokkenheid van mantelzorgers en de grote sociaal-economische last die dit zo vaak oplegt.