Concurrerende Homing Testen om de Gut-tropische T-cel-migratie Study

Samenvatting

Concurrerende homing experimenten toelaten om rechtstreeks de beoordeling van de trekkende eigenschappen van twee verschillende celpopulaties in een muis. Hier hebben we illustreren deze procedure door het vergelijken van de migratie van ex vivo gegenereerde gut-tropische versus niet-gut tropische T-cellen.

Samenvatting

Om te oefenen hun functie lymfocyten moet het bloed te verlaten en in verschillende weefsels in het lichaam migreren. Lymfocyten hechting op endotheliale cellen en weefsels extravasatie is een complex proces gecontroleerd door verschillende adhesiemoleculen (homing-receptoren) uitgedrukt op lymfocyten en hun respectieve liganden (addressins) getoond op endotheelcellen ^{1 2.} Ook al is de functie van deze receptoren hechting kan gedeeltelijk worden bestudeerd ex vivo, de ultieme test voor hun fysiologische relevantie is om hun rol te evalueren tijdens de in-vivo-lymfocyten adhesie en migratie. Twee complementaire strategieën zijn gebruikt voor dit doel: intravitale microscopie (IVM) en homing experimenten. Hoewel de IVM is essentieel om de precieze bijdrage van specifieke adhesie receptoren tijdens de hechting cascade in real time en in verschillende weefsels te definiëren, IVM is tijdrovend en arbeidsintensief, vaak de ontwikkeling van geavanceerde chirurgische technieken vereist, moet het voorafgaande scheiding van homogene celpopulaties en het mogelijk maakt de analyse van slechts een weefsel / orgaan op een bepaald moment. Daarentegen, concurrerende homing experimenten laat de directe en gelijktijdige vergelijking in de migratie van twee (of zelfs meer) cel subsets in dezelfde muis en ze ook toestaan ​​dat de analyse van een groot aantal weefsels en van een groot aantal cellen in hetzelfde experiment.

Hier beschrijven we de klassieke concurrerende homing protocol dat wordt gebruikt in het voordeel / nadeel van een bepaald celtype te bepalen naar huis om specifieke weefsels in vergelijking met een controle-celpopulatie. We hebben ervoor gekozen om de trekkende eigenschappen van darm-tropische versus niet gut-tropische T-cellen te illustreren, omdat het darmslijmvlies is de grootste lichaamsoppervlak in contact met de externe omgeving en het is ook de extra-lymfoïde weefsel met de beste gedefinieerde trekkende eisen . Bovendien heeft recent werk vastgesteld dat de vitamine A metaboliet all-trans retinoïnezuur (RA) is de belangrijkste moleculaire mechanisme dat verantwoordelijk is voor het induceren van darm-specifieke aanhechting receptoren (integrine a4b7and chemokine-receptor CCR9) op lymfocyten. Zo kunnen we snel grote aantallen van darm-tropische als niet-tropische darm lymfocyten ex vivo door het activeren van T-cellen in de aanwezigheid of afwezigheid van RA, respectievelijk, die uiteindelijk kan worden gebruikt in de concurrerende homing experimenten hier beschreven.

Protocol

1. Ex vivo generatie van darm-homing en controle op T-cellen (zie figuur 1)

1. Isoleer splenocyten door stampen een milt van wild-type muizen. Resuspendeer de cellen suspensie in PBS en centrifugeer gedurende 5 'op 400 x g. Verwijder het supernatant en lyseren van de rode bloedcellen door resuspenderen de cel pellet in 4 ml van ACK lysis buffer voor 2-3 minuten. Daarna, voeg 5 ml PBS. Centrifugeer gedurende 5 'op 400 xg en verwijder het supernatant.
2. Resuspendeer totaal splenocyten op 1 x 10 ⁶ / ml in IMDM + 10% FBS + 50 mM 2-mercapto-ethanol + penicilline / streptomycine (compleet IMDM). Scheid de cellen in twee groepen, waarvan er een is met RA (of synthetische RAR-agonisten, zoals Am80 of Am580), aangevuld tot een uiteindelijke concentratie van 100-200 nM ^3. T-cellen geactiveerd in de aanwezigheid van een RA-of RAR-agonisten zullen upregulate a4b7and CCR9 en zal gut-tropische T-cellen, terwijl T-cellen geactiveerd zonder RA zal controle T-cellen.
3. Voeg 1,5-2,0 ml van de celsuspensie in elk putje van een 24-wells plaat voorheen bekleed met anti-CD3 (10 mg / ml) en anti-CD28 (10 mg / ml) toe en incubeer bij 37 ° C in 5% CO ₂ (voor het coaten van de plaat toe te voegen 500 ml / putje van anti-CD3 plus anti-CD28 in PBS en incubeer gedurende 2 uur bij 37 ˚ C en vervolgens twee keer wassen met 2 ml PBS).
4. Om de T-cel overstimulatie te vermijden, overdragen na 2-3 dagen de cel suspensies in een nieuwe ongestreken 24-well plaat. Incubeer extra 2-3 dagen. Afhankelijk van de celdichtheid en proliferatie in de media zou kunnen worden zuur (geel), in welk geval kan het noodzakelijk zijn om de helft van de media te vervangen door verse volledig IMDM. Oogst de cellen na 4-5 dagen (te rekenen vanaf dag 0).
5. Typische uiteindelijke opbrengsten zijn 1-2 x 10 ⁶ effector-T-cellen / well. Daarom moet een minimum van 9-12 putten van elk darm-tropische T-cellen en T-cellen controle worden uitgeplaat in om te eindigen met 10-20 x 10 ⁶ T-cellen per conditie.

2. Analyse van de darm-homing receptoren op de geactiveerde T-cellen

Na 4-5 dagen van de cultuur die we moeten houden aan een hoge expressie van darm-homing receptoren a4b7and CCR9 op T-cellen geactiveerd in de aanwezigheid van een RA-of RAR-agonisten, terwijl controle T-cellen moeten verwoorden zeer lage niveaus van deze receptoren ^4.

Flowcytometrie (FACS) analyse.

1. Verzamel tussen 0,2-0,5 x10 ⁶ cellen en centrifugeer 5 minuten bij 300 g bij 4 ° C.
2. Incubeer met anti-CD4-FITC, anti-a4b7-PE (BD Biosciences), anti-CCR9-APC (eBiosciences) en anti-CD8-PercP gedurende 15 min bij 4 ° C in het donker.
3. Na de incubatie, centrifuge gedurende 5 minuten bij 300 g 4 ° C. Wassen en de cellen resuspendeer in kleuren buffer en analyseren door FACS.

3. T-cel etikettering met CFSE en CMTMR cel trackers

1. Houd alle oplossingen bij 37 ° C alvorens te beginnen. Was gut-tropische T-cellen (a4b7 ^High CCR9 ^Hoog) en controle op T-cellen (a4b7 ^{Low / Neg} CCR9 ^{Low / Neg)} tweemaal met PBS om het serum te verwijderen. Pas de T-cel-concentratie tot 10-15 x 10 ⁶ / ml in PBS.
2. Voeg CFSE (carboxyfluoresceïne succinimidylester) of CMTMR (chloormethyl-benzoyl-amino-tetramethylrodamine) fluoroforen ofwel gut-tropische T en controle T-cellen tot een uiteindelijke concentratie van 5 mm en 10 mm, respectievelijk, zacht vortex en incubeer gedurende 20 minuten bij 37 ° C. Het wordt aanbevolen om de labelings swap in dezelfde of in een afzonderlijk experiment om potentiële intrinsieke effecten van fluoroforen op de T-cel migratie uit te sluiten.
3. Na de incubatie, blussen met een volume van FBS en incubeer voor 1-5 min bij kamertemperatuur. Verdun 10 keer met warm PBS en centrifugeer 5 minuten bij 300 g. Was tweemaal met PBS en resuspendeer in complete IMDM.
4. Idealiter zou 10 tot 20 x 10 ⁶ cellen van elk T bevolking worden gemengd in een 1:1 verhouding en vervolgens gecentrifugeerd bij 300 xg gedurende 5 minuten. Ten slotte is resuspendeer de cellen in 200-250 ml van de warme PBS en injecteren via de staartader.
5. Voor het berekenen van de exacte ingang ratio (ideale ligging dicht bij 1) op te slaan 5-10 ml van de geïnjecteerde celsuspensie en verdun met 300 ml PBS en analyseren door FACS.

4. Analyse van de T-cel homing

Hoewel muizen kunnen worden geanalyseerd op verschillende tijdstippen (tussen 1 uur en enkele dagen na de T-cel-injectie), is homing van darm-tropische T-cellen best gedocumenteerde tussen de 12-24 uur na de injectie. Langere tijd punten te verhogen van de potentiële effecten van andere variabelen die de laatste cel aantallen / verhoudingen, zoals T-cel apoptose en T-cel af te sluiten uit het weefsel. Nadat de muizen zijn gedood, celsuspensies van verschillende weefsels moeten worden geïsoleerd zonder uitstel om celdood verlagen, kan dat invloed op de uiteindelijke opbrengsten en resultaten. Weefsels van belang zijn de dunne darm, dikke darm, milt, lymfeklieren, plaques van Peyer, lever, longen en bloed. Als hetgeïnjecteerd T-cellen zijn bona fide gut-tropische T-cellen, moeten zij thuis gemiddeld 5-10 keer beter (of hoger) naar de dunne darm slijmvlies in vergelijking met de T-cellen te controleren. Moet echter andere weefsels, zoals bloed en de milt, niet vertonen een preferentieel T-cel migratie. Isolatie van lymfocyten uit de darm lamina propria en de intra-epitheliale compartiment is eerder beschreven ^5.

1. FACS kleuring: De monsters worden geresuspendeerd, afhankelijk van het aantal cellen verzameld, met een dichtheid niet hoger dan 3,0 x 10 ⁶ cellen / ml. Als congenic CD45.1 ⁺ of Thy1.1 ⁺ muizen werden gebruikt als ontvangers, worden de cellen gekleurd met de bijbehorende congenic marker (bijv. CD45.2 of Thy1.2) in combinatie met een aantal afstamming marker (bijv. TCRbchain, CD4, CD8 , CD45.1 ⁺ / CD45.2 ^+).
2. Tijdens de FACS-analyse, cellen gated op de congenic marker (bijv. CD45.1) en vervolgens op de specifieke lijn markers (bijv. CD4/CD8) en geanalyseerd op de verhouding tussen CMTMR en CFSE positieve cellen.
3. De gegevens worden gewoonlijk uitgedrukt als de Homing Index (HI), die wordt berekend als de verhouding CFSE / CMTMR (of CMTMR / CFSE) in elk weefsel, gedeeld door de corresponderende ingang ratio (zie hieronder). Als de input-verhouding is zeer dicht bij 1, dan is het weefsel ratio's zullen gelijk zijn aan de HI.

HI = CFSE _weefsel / CMTMR _weefsel: CFSE _input / CMTMR _ingang

Bloed moet ook worden geanalyseerd om te bepalen of beide T-celpopulaties gelijk vertegenwoordigd zijn in de circulatie, of als een T-cel populatie wordt verlaagd respect naar de andere (bijvoorbeeld door preferentiële vangen in de longen / lever of door een verminderde levensvatbaarheid). Dit kan gebeuren bij het vergelijken naïef of rusten geheugen T-cellen ten opzichte van recentelijk geactiveerde effector-T-cellen, aangezien dit kan worden afgevangen om een ​​grotere mate in de longen. Als de HI in het bloed is significant anders is dan 1, kan een HI normaliseren in de weefsels door de HI in het bloed. Bloed kan worden verkregen via het hart doorboren van muizen verdoofd (met Avertin of isofluorane voor euthanasie) en moet twee keer worden gelyseerd met ACK buffer voordat u deze voor FACS kleuring.

Bloed normaliseren = HI _weefsel / HI _Blood

5. Representatieve resultaten

Ontvangende muizen (Thy1.1 ⁺⁾ waren euthanized18h na de cel injectie. Celsuspensies werden gegenereerd uit de milt, perifere lymfeklieren (PLN), mesenteriale lymfeklieren (MLN) en de dunne darm lamina Propia (LP). Na dat de cellen werden gekleurd voor Thy1.2 en CD8 en vervolgens geanalyseerd door FACS door gating op levensvatbare Thy1.2 ⁺ CD8 ⁺ cellen, die uiteindelijk werden geanalyseerd op de verhouding tussen CMTMR ⁺ cellen (darm-tropische T-cellen) en de CFSE ⁺ cellen (controle T-cellen) gedeeld door de input-ratio. De resultaten kunnen worden weergegeven zoals in figuur 2, waarin het kan worden begrepen dat gut-tropische en controle T-cellen homed ook voor de milt (HI dicht tot1, aangegeven met een rode lijn). Daarentegen, gut-tropische T-cellen migreerden ongeveer 10 keer efficiënter naar de LP in vergelijking met de T-cellen te controleren.

Figuur 1:. Diagram van de generatie en de etikettering van darm-tropische en niet-gut tropische T-cellen T-cellen worden geïsoleerd van wild-type muizen en geactiveerd met anti-CD3/anti-CD28 en in de aanwezigheid of afwezigheid van 100-200 nM alle - trans retinoïnezuur (RA). Na 4-5 dagen RA behandeld met T-cel het verwerven van de expressie van de darm homing receptoren CCR9 en a4b7. Vervolgens worden gut-tropische en controle T-cellen verschillend gelabeld met CFSE of CMTMR, gewassen, gemengd in een verhouding van 1:1 en geïnjecteerd in een ontvanger muis via de staartader. Een aantal gelabelde cellen worden gebruikt om de CFSE / CMTMR ingang ratio (moet dicht bij 1 worden) te bepalen.

Figuur 2:. Voorbeeld van een homing analyse Muizen geanalyseerd 12-18 uur na de T-cel-injectie en single celsuspensies worden verkregen uit de organen van belang. De cellen zijn gekleurd met anti-Thy1.2 (congenic marker) plus anti-CD8 en dan Thy1.2 ⁺ CD8 ⁺ T-cellen worden geanalyseerd op de verhouding van CMTMR ⁺ en CFSE ⁺ cellen in elk weefsel door FACS. Het weefsel CMTMR / CFSE ratio's worden vervolgens genormaliseerd door de Input CMTMR / CFSE verhouding tot de homing indices (HI) te verkrijgen. In dit voorbeeld CMTMR ⁺ en CFSE ⁺ cellen zijn darm-tropische en controle effector T-cellen, respectievelijk.

Discussie

Hoewel homing experimenten zorgen voor een zeer waardevolle informatie over de migratie van het totaal celpopulaties in een bepaald weefsel, moet in gedachten worden gehouden dat deze testen niet rechtstreeks endotheel hechting daarom te analyseren en niet discrimineren, waarin stap (pen) van de meerstaps hechting cascade (tethering / rollen, activering of plakken) een bepaalde homing receptor optreedt. De gouden standaard om de specifieke rol van de homing-receptoren te definiëren in de hechting cascade is intravitale ...

Materialen

Dieren: C57BL / 6 muizen worden vaak gebruikt voor het T-cel isolatie. Daarnaast, CD45.1 en Thy1.1 congenic stammen zijn beschikbaar via Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME).

Cultuur media: IMDM (Iscove's gemodificeerd Dulbecco's Medium + L-Glutamine + Hepes) plus 10% hitte-geïnactiveerd FBS (Fetal Bovine Serum, een lage endotoxine, Gibco ®, Invitrogen, Carlsbad, CA), aangevuld met 100 U / ml penicilline, 100 mg / ml streptomycine (Hyclone Antibiotica, Waltham, MA), 0,5 mg / ml fungizone / amfotericine B (Gibco), en 50 mM b-mercapto-ethanol.

ACK Red Blood Cell Lysis buffer (RBC, 10 mM KHCO _3, 150 mM NH ₄ Cl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0), aan te passen aan de pH 7,2-7,4 en op te slaan op kamertemperatuur).

PBS (fosfaat gebufferde fysiologische zoutoplossing, Hyclone, Waltham, MA).

Flowcytometrie (FACS) media (PBS of IMDM + 2% FBS + 5 mM EDTA). Wanneer kleuring met behulp van selectine-Fc hersenschimmen, media met 2 mM Ca ^{+ +} moet worden gebruikt in alle stappen (inclusief FACS acquisitie). IMDM is aan te bevelen in dit geval.

T-cel etikettering en de adoptieve overdracht: CFSE (carboxyfluoresceïne diacetaat, succinimidylester), CMTMR ((5 - (en-6 )-((( 4-chloormethyl) benzoyl) amino) tetramethylrodamine) van Molecular Probes ®, Invitrogen, Carlsbad, Californië ). 1000 x voorraden moeten worden gemaakt in DMSO (5 mM CFSE, 20 mM CMTMR) en opgeslagen bij -20 ° C.

Polyklonale T-cel activatie: 24-well of 96-well platen (tissue-cultuur behandeld, polystyreen, vlakke bodem met deksel, BD Falcon, Franklin Lakes, New Jersey) zijn gedurende 2 uur bij 37 ° C met 50 ml PBS, met respectievelijk , met anti-CD3 plus anti-CD28 antilichamen (10 mg / ml per stuk). Vervolgens worden kweekplaten tweemaal gewassen met PBS en direct gebruikt voor de T-cel cultuur. Als alternatief kan Dynabeads gecoat met anti-CD3/anti-CD28 (Dynal, Invitrogen, Carlsbad, CA) worden gebruikt voor de T-cel activatie in plaats van plaat-gebonden antilichamen.

Flowcytometrie (FACS) kleuring: Polyklonale activering: CD3 (1452C11), CD28 (37.51). Lineage mAb: CD4 (L3T4), CD8a (Ly-2), Thy1.2 (CD90.2/53-1.2), CD45.2 (104). Gut-homing receptoren: gezuiverd CCR9 (CD199/eBioCW-1.2, eBioscience, San Diego, CA), a4b7 (LPAM-1/DATK3), isotype controle (IgG2a, k). Skin-homing receptoren: P-selectine-Fc (Gezuiverd Mouse P-selectine - IgG-fusie-eiwit, BD Pharmingen, San Jose, CA), E-selectine-Fc (Recombinant Mouse E-Selectin/Fc Chimera, R & D Systems, Minneapolis, MN) plus bijbehorende secundaire reagens geit F (ab ') 2 anti-humaan IgG R-PE (Invitrogen, Carlsbad, CA).

All-trans-retinoïnezuur (Sigma, St. Louis, MO) is geresuspendeerd in absolute ethanol of DMSO met behulp van een gele lamp of een onrechtstreeks, een bron van licht tijdens de voorbereiding. Bewaar aliquots in glazen flesjes bij -80 ° C en beschermd tegen licht te allen tijde. Synthetische RAR-agonisten: Am80 (Wako Chemicals, Richmond, VA).