Whole-mount Immunohistochemische Analyse voor Embryonale Limb Skin vaatstelsel: een modelsysteem voor Vasculaire Vertakkingen Morphogenesis in Embryo Study

Samenvatting

We introduceren een hele-mount immunohistochemie en laser scanning confocale microscopie met meerdere etikettering voor het analyseren van complexe vasculaire netwerk-vorming in de muis embryonale ledematen huid.

Samenvatting

Whole-mount immunohistochemische analyse voor de beeldvorming van de hele vasculatuur is cruciaal voor het begrijpen van de cellulaire mechanismen van vertakking morfogenese. We hebben de ledemaat huid vasculatuur model vasculaire ontwikkeling, waarbij een reeds bestaande primitieve capillaire plexus is omgevormd tot een hiërarchisch vertakte vasculaire netwerk te bestuderen. Whole-mount confocale microscopie met meerdere etikettering maakt voor robuuste beeldvorming van intacte bloedvaten evenals hun cellulaire componenten, waaronder endotheelcellen, pericyten en gladde spiercellen, met behulp van specifieke fluorescente merkers. Vooruitgang in dit onderdeel de huid vaatstelsel model met genetische studies hebben een beter begrip moleculaire mechanismen van vasculaire ontwikkeling en patroonvorming. De ledematen huid vasculatuur model is gebruikt om te bestuderen hoe perifere zenuwen een ruimtelijk model voor de differentiatie en patroonvorming van de slagaders. Deze video artikel beschrijft een eenvoudige en robuuste protocol om intact bloedvaten vlek met vasculaire specifieke antilichamen en fluorescente secundaire antilichamen, die van toepassing is voor de gevasculariseerd embryonale organen waar we in staat zijn om het proces van vasculaire ontwikkeling te volgen.

Protocol

1. Het verzamelen van muis embryonale Limb Skin (E13.5 ~ E17.5)

1. Euthanaseren aangesloten vrouwen door erkende procedure. Volgens onze goedgekeurde dieren protocol worden de vrouwtjes gedood door de CO ₂ belichting en vervolgens verzekerd door cervicale dislocatie. Leg het dier op haar absorberende papieren handdoek en grondig laat deze in 70% EtOH / H ₂ O uit een knijpfles.
2. Ontleden de baarmoeder intact en plaats deze in een 100 x 15 mm petrischaal met Balanced Salt ijskoude Hanks 'Solution (HBSS) uit te spoelen bloed.
3. Scheiden en ontleden van de embryo. Verwijder de zeer dunne amnion van het embryo.
4. (Optie) Prepareer een enkel embryo in een 35 x 10 mm petrischaal als elk embryo moet worden gegenotypeerd. Ontleed staart is overgebracht naar een 0,2 ml PCR-buis voor genotypering.
5. Snijd de voorpoten van de embryo en de overdracht voorpoten door een ring tang in 24 wells plaat met 2 ml ijskoude verse 4% paraformaldehyde (PFA) in fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS).
6. Bevestig de voorpoten met zachte mengen op de Nutator Mixer bij 4 ° C gedurende de nacht.
7. Op de volgende dagen, verwijder de PFA en was drie keer voor 5 min in 2 ml PBS met zachte mengen op de Nutator Mixer bij kamertemperatuur.
8. Breng de voorpoten in 100% methanol (MeOH) en bewaar deze bij -20 ° C vriezer enzym (de vriezer met een kritische temperatuur controle en zonder automatische ontdooifunctie). Primaire antilichamen vermeld in tabel 1 het werk na de 100% MeOH behandeling.
9. Verwijder de huid van de voorpoot met fijne pincet. Limb huid, toen uitgedroogd, moet gemakkelijk los van de ledemaat. Eerste plaats de ledematen met ventrale zijde (handpalm zijde) naar boven gericht. Vervolgens met behulp van fijne pincet, snijd de huid zoals in de video. Volgende ontleden door het hele ledemaat, peeling van de huid af voorzichtig, zonder enige schade.

2. Whole-mount immunohistochemische kleuring van Limb Skins

1. Hydrateren van de ledematen huiden in 5 ml polypropyleen ronde bodem buis door het incuberen van door de gesorteerde reeks van MeOH / PBT (PBS + 0,2% Triton X-100) (75%, 50%, 25%) gedurende 5 minuten elk. Merk op dat de uitwisseling van oplossingen moeten voorzichtig om te voorkomen dat schade aan de ledematen skins.
2. Was twee keer voor 5 min in PBT met zachte mengen op de Nutator Mixer bij kamertemperatuur.
3. Blokkeer de ledematen skins met ofwel 10% Geit serum / PBS +0.2% TX100 blokkerende buffer voor de geit secundaire antilichamen of 10% Donkey serum / PBS +0.2% TX100 blokkerende buffer voor de ezel secundaire antilichamen gedurende 2 uur met een voorzichtig mengen op de Nutator Mixer op kamertemperatuur.
4. Plaats de ledemaat skins op een 35 x 10 mm petrischaal en overdracht door een ring tang in 2ml-microcentrifugebuis met 800μl van primaire antilichamen (juiste verdunning zoals vermeld in de tabellen) in de blokkerende buffer (ofwel 10% Geit serum / PBS +0.2 TX100% of 10% Donkey serum / PBS +0.2% TX100). Incubeer de ledematen huiden met voorzichtig mengen op de Nutator Mixer bij 4 ° C gedurende de nacht. Merk op dat meerdere primaire antilichamen afgeleid van verschillende soorten (bijvoorbeeld rat monoklonaal antilichaam + konijn polyklonaal antilichaam) kunnen gelijktijdig worden gebruikt.
5. Op de volgende dag, plaatst u de ledemaat skins op een 35 x 10 mm petrischaal en overdracht door een ring tang in 5 ml polypropyleen ronde bodem buis met 4 ml van de wasbuffer (ofwel 2% Geit serum / PBS +0.2% TX100 of 2 Donkey% serum / PBS +0.2% TX100).
6. Was vijf keer gedurende 15 minuten met voorzichtig mengen op de Nutator Mixer bij kamertemperatuur.
7. Plaats de ledemaat skins op een 35 x 10 mm petrischaal en overdracht door een ring tang in 2ml-microcentrifugebuis met 800μl van secundaire antilichamen in het blokkerende buffer (ofwel 10% Geit serum / PBS +0.2% TX100 of 10% Donkey serum / PBS +0,2% TX100). Normaal gesproken gebruiken we secundaire antilichamen uit Jackson ImmunoResearch (Cy3, Cy5, 1:300 verdunningen) of Invitrogen (Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 633, 1:250 verdunning). Filter het secundaire antilichaam-oplossing met behulp van 0.22μm PVDF membraan spuit filters om geaggregeerde deeltjes van de secundaire antilichamen te verwijderen. Incubeer de ledematen skins in het donker of omwikkeld met aluminium folie gedurende 1 uur met een voorzichtig mengen op de Nutator Mixer bij kamertemperatuur. Merk op dat verschillende fluorescerende geconjugeerd secundair antilichamen afgeleid van verschillende soorten kunnen gelijktijdig worden gebruikt.
8. Plaats de ledemaat skins op een 35 x 10 mm petrischaal en overdracht door een ring tang in 5 ml polypropyleen ronde bodem buis met 4 ml van de wasbuffer (ofwel 2% Geit serum / PBS +0.2% TX100 of 2% Donkey serum / PBS +0.2% TX100). Was vijf keer gedurende 15 minuten in het donker of omwikkeld met aluminium folie met voorzichtig mengen op de Nutator Mixer bij kamertemperatuur.
9. (Optie voor tegenkleuring tegen de kern) Incubeer de ledematen huiden met 4 ml van de wasbuffer (ofwel 2% Geit serum / PBS +0.2% TX100 of 2% Donkey serum / PBS +0.2% TX100) met To-Pro-3 (Invitrogen T3605 , 1:3000 verdunning) in het donker of omwikkeld met aluminium folie gedurende 10 minuten met een voorzichtig mengen op de Nutator Mixer bij kamertemperatuur temperare. Daarna, was drie keer voor 5 min met 4 ml van de wasbuffer (ofwel 2% Geit serum / PBS +0.2% TX100 of 2% Donkey serum / PBS +0.2% TX100) in het donker of verpakt door aluminium folie met zachte mixen op de Nutator Mixer bij kamertemperatuur. Merk op dat sterke en specifieke kleuring voor de kernen is waargenomen voor To-pro-3 in een specifieke emissie (HeNe 633 nm excitatie).

3. Montage van de Limb Skins op dia

1. Plaats de ledemaat skins op een 35 x 10 mm petrischaal. Verwijderen stof, kristallen, vezels van de binnenste laag van de huid met behulp van fijne pincet onder de stereomicroscoop met een lage verlichting tot uitgebreide foto bleken te voorkomen.
2. Breng de ledematen skins om lijm microscopisch preparaat door een ring tang. Leg de huiden met de binnenste laag liggend naar boven op de dia (dwz naar dekglaasje). Platter de huiden zorgvuldig met fijn pincet en verwijder de carry-over wasbuffer door Kimwipe.
3. Monteren in anti-fade montage media zonder luchtbellen. We maken gebruik van 25 "x25" dekglaasje aan. Cure op een vlakke ondergrond in het donker (bijvoorbeeld de monsters bevestigd met Gold reagens ProLong worden 's nachts geplaatst in het donker bij kamertemperatuur voordat u deze bekijkt). Voor de lange-termijn opslag, sluit de dekglaasje aan de dia en bewaar bij 4 ° C.

4. Confocale microscopie

1. Opzetten van passende lasers voor fluoroforen. We maken gebruik van Leica TCS SP5 confocale microscoop met drie bronnen, waaronder laser-Argon 488nm (voor Alexa Fluor 488 en GFP), DPSS 561nm (voor Alexa Fluor 568 en Cy3) en HeNe 633nm (voor Alexa Fluor 633, Cy5 en To-Pro-3) .
2. Gebruik opeenvolgende scanner te voorkomen of te verminderen crosstalk in waarin alle kleurstoffen in dubbele of drievoudige-gekleurde monsters worden opgewonden tegelijk. In de sequentiële scan-modus worden beelden worden vastgelegd in een volgorde.
3. Meer algemene informatie over de fluorescente kleurstoffen en lasers voor excitatie kunnen worden opgericht "confocale microscopie voor biologen" door Hibbs (2004)

5. Representatieve resultaten

Whole-mount triple-label confocale microscopie immnofluorescence in de muis voorpoot huid E15.5 met antilichamen tegen de pan-endotheliale cel marker PECAM-1 (Figuur 1A-C, D blauw), de neurofilament marker 2H3 (Figuur 1A groen), en de gladde spiercel marker αSMA (Figuur 1A, B rood) onthulde een karakteristiek patroon van vertakking αSMA ⁺ slagaders, in lijn met 2H3 ⁺ perifere zenuwen in de ledematen huid. Naast het bloedvat vertakking, is dit onderdeel skin vasculatuur model gebruikt om de patronen van lymfevat vertakkingen met behulp van antilichamen tegen het lymfatische endotheelcel marker LYVE-1 (figuur 1D, E rood) en Neuropilin2 (NRP2) (figuur 1D, F groene studie ).

Figuur 1. (AC) Slagaders lijn te brengen met perifere zenuwen in de embryonale ledematen huid. Whole-mount triple-label confocale microscopie immnofluorescence met antilichamen tegen de pan-endotheliale cel marker PECAM-1 (AC, blauw), de neurofilament marker 2H3 (A, groen), en de gladde spiercellen marker αSMA (A en B, rood ) is weergegeven. Bij E15.5, 2H3 ⁺ perifere zenuwen (open pijlen) associëren met slagaders (pijlpunten), die vallen onder αSMA ⁺ gladde spiercellen. (DF) Lymfatische bloedvaten in de embryonale ledematen huid. Triple-label confocale microscopie immnofluorescence met antilichamen tegen de pan-endotheliale cel marker PECAM-1 (D, blauw), de lymfatische endotheelcel marker LYVE-1 (D en E, rood) en Neuropilin2 (NRP2) (D en F, groen ) is weergegeven. Lymfevaten worden gevisualiseerd door zowel LYVE-1 en NRP2, terwijl LYVE-1 wordt ook uitgedrukt door een subset van macrofagen (open pijlpunten). Schaal bar: 100 urn.

Discussie

Het vasculaire systeem is cruciaal voor orgel ontwikkeling tijdens de embryogenese, alsook voor orgel onderhoud en reproductieve functies in de volwassenen, want het levert voldoende zuurstof en voedingsstoffen naar de organen. Een goede vasculaire netwerk is goed opgezet met complexe en multi-step processen angiogenese waarbij reeds bestaande capillaire netwerk wordt gereorganiseerd met zeer vertakte en hiërarchische structuren. Hoewel talrijke werken is aangetoond dat een verscheidenheid van moleculen is betrokken bij...

Materialen

Antilichamen

Pan-endotheliale cel marker

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Antilichaam	Soorten	Vennootschap	Catalogus #	Werkende staat
PECAM-1	Armeense hamster (M)	Chemicon	MAB1398Z	1:100 verdunning # 1
PECAM-1	Rat (M)	BD	553369	1:300 verdunning
VEGFR2	Rat (M)	eBioscience	14-5821-82	1:200 verdunning
CD34	Rat (M)	eBioscience	13-0341	1:300 verdunning
Collageen IV	Konijn (P)	AbD Serotec	2150-1470	1:300 verdunning # 2

Arteriële endotheelcellen marker

Antilichaam	Soorten	Vennootschap	Catalogus #	Werkende staat
Neuropilin1	Konijn (P)	The Alex Kolodkin's lab # 3		1:3000 verdunning
Unc5H2	Geit (P)	R & D	AF1006	1:200 verdunning

Veneuze endotheelcellen marker

Antilichaam	Soorten	Vennootschap	Catalogus #	Werkende staat
EphB4	Geit (P)	R & D	AF446	1:100 verdunning

Lymfatische endotheelcellen marker

Antilichaam	Soorten	Vennootschap	Catalogus #	Werkende staat
LYVE-1 # 4	Konijn (P)	Abcam	ab14917	1:200 verdunning
LYVE-1 # 4	Rat (M)	MBL	D225-3	1:200 verdunning
Prox-1	Konijn (P)	Chemicon	AB5475	1:1000 verdunning
Prox-1	Geit (P)	R & D	AF2727	1:50 verdunning
Neuropilin2	Konijn (P)	Cell Signaling	3366	1; 100 verdunning
Podoplanin	Syrische hamster (M)	Hybridoma Bank	8.1.1	1:200 verdunning

Gladde spiercellen / pericyte marker

Antilichaam	Soorten	Vennootschap	Catalogus #	Werkende staat
αSMA-Cy3	Muis (M) # 5	Sigma	c-6198	1:500 verdunning # 6
NG2	Konijn (P)	Chemicon	AB5320	1:200 verdunning
SM22α	Konijn (P)	Abcam	ab14106	1:200 verdunning

Antilichamen voor GFP reporter

Antilichaam	Soorten	Vennootschap	Catalogus #	Werkende staat
GFP	Konijn (P)	Invitrogen	A11122	1:300 verdunning
GFP	Rat (M)	Nacalai tesque	04404-84	1:1000 verdunning
GFP	Chick (P)	Chemicon	P42212	1:300 verdunning

Antilichamen voor LacZ reporter

Antilichaam	Soorten	Vennootschap	Catalogus #	Werkende staat
β-gal	Konijn (P)	MP Biomedische	55976	1:5000 verdunning
β-gal	Geit (P)	AbD Serotec	4600-1409	1:500 verdunning
β-gal	Chick (P)	Abcam	ab9361	1:200 verdunning

Antilichamen voor perifere axon

Antilichaam	Soorten	Vennootschap	Catalogus #	Werkende staat
2H3	Muis (M) # 7	Hybridoma Bank	2H3	1:200 verdunning
Tuj1	Muis (M) # 8	Covance	MMS-435P	1:500 verdunning
Peripherin	Konijn (P)	Chemicon	AB1530	1:1000 verdunning

Antilichamen voor de migratie Schwann-cellen

BFABP	Konijn (P)	De Thomas Müller lab # 9		1:3000 verdunning

(P): polyklonaal antilichaam, (M): monoklonaal antilichaam

# 1: geit anti-Armeense hamster-Cy3 (Jackson ImmunoResearch 127-165-160) antilichaam moet worden gebruikt als een secundair antilichaam.

# 2: De Collagen IV antistof kan worden gebruikt om de bloedvaten te sporen na in situ hybridisatie.

# 3: De Neuropilin1 antilichaam wordt vriendelijk verzorgd door het laboratorium van de Alex Kolodkin in de Johns Hopkins University. Schapen anti-humaan antilichaam Neuropilin1 is verkrijgbaar in R & D (AF3870), hoewel we nog niet getest nog niet.

# 4: De LYVE-1-antilichamen ook detecteren een subset van macrofagen in de embryonale huid.

# 5: De anti-αSMA antilichaam is muizen IgG2a monoklonaal antilichaam.

# 6: De Cy3-geconjugeerde αSMA antilichaam wordt gedurende 1 uur bij kamertemperatuur samen met de secsecundaire antilichamen voor andere primaire antilichamen.

# 7: 2H3 antilichaam is muis IgG1 monoklonaal antilichaam tegen neurofilament.

# 8: Tuj1 antilichaam is muizen IgG2a monoklonaal antilichaam tegen Neuron-specifieke klasse III beta-tubuline.

# 9: De BFABP (hersen-specifieke vetzuur bindend eiwit) antilichaam wordt ter beschikking gesteld door het laboratorium van de Thomas Müller in Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine.