Demonstratie van het gebruik van de Novel zwaartekracht Spectrometer te rekken en te meten Stapel-eiwitten

Samenvatting

Dit is een stap-voor-stap handleiding toont het doel, de werking, en representatieve resultaten van de roman zwaartekracht spectrometer.

Samenvatting

De studie van macromoleculaire structuur is geworden van cruciaal belang voor het ophelderen van de moleculaire mechanismen en functie. Er zijn verschillende beperkte, maar belangrijke bioinstruments geschikt voor het testen van de kracht afhankelijkheid van structurele kenmerken in eiwitten. Schaal is een beperkende parameter over hoe nauwkeurig onderzoekers kunnen peer in de nanomechanical wereld van moleculen, zoals nucleïnezuren, enzymen, en de motor eiwitten die levensverlengend werken uit te voeren. Atomaire kracht microscopie (AFM) is goed afgestemd op eigen structuren van de vezelachtige eiwitten te bepalen met een resolutie van afstand op gelijke voet met elektronenmicroscopie. Echter, in AFM kracht studies, de krachten zijn meestal veel hoger dan een enkel molecuul kan ervaring ^{1, 2.} Optische vallen (OT) zijn erg goed in het bepalen van de relatieve afstand tussen de kralen opgesloten en ze kunnen overbrengen zeer kleine krachten ^3. Echter, ze niet toegeven accurate absolute lengte van de moleculen onder studie. Moleculaire simulaties geven ondersteunende informatie om dergelijke experimenten, maar zijn beperkt in de mogelijkheid om het dezelfde grote moleculaire afmetingen, lange tijd frames, handvat en overtuigen sommige onderzoekers in de afwezigheid van andere bewijsstukken ^{2, 4.}

De zwaartekracht spectrometer (GFS) vult een kritische niche in het arsenaal van een onderzoeker door middel van een unieke combinatie van vaardigheden. Dit instrument is in staat om het genereren van krachten meestal met 98% of beter nauwkeurigheid van de femtonewton reeks tot de nanonewton bereik. De afstand metingen op dit moment in staat zijn om het oplossen van de absolute moleculaire lengte tot vijf nanometer, en de relatieve kraal paar afstanden met een precisie die vergelijkbaar met een optische val. Ook kan het GFS bepalen uitrekken of afrollen waar de kracht ligt in de buurt evenwicht, of een gegradeerde kracht om naast elkaar tegen alle gemeten structurele veranderingen. Het is zelfs mogelijk om te bepalen hoeveel aminozuur residuen zijn betrokken bij het ​​afrollen gebeurtenissen onder fysiologische kracht belastingen ^2. In tegenstelling tot in andere methoden waar sprake is van een uitgebreide kalibratie van kracht dat elke test moet voorafgaan, de GFS vereist geen zo'n kracht kalibratie ^5. Door het aanvullen van de sterke punten van andere methoden, zal het GFS brug hiaten in het begrijpen van de Nanomechanica van vitale eiwitten en andere macromoleculen.

Protocol

Inleiding tot de Novel GFS-configuratie

Het GFS bestaat uit een aantal essentiële onderdelen: Een regelmatige lichtmicroscoop, een equatoriale montering, een camera en een computer [Figuur 1]. De verzegelde flow-cell kamer die het monster houdt is ook onmisbaar op basis van de GFS ontwerp. Het Licht microscoop is gemonteerd op de equatoriale montering, zodat de ruimte kan worden gedraaid in verschillende oriëntaties in de ruimte. Dit vermogen kan de statische vector van de zwaartekracht worden benut, zodat de monsters kunnen dynamisch georiënteerd zijn ten opzichte van de vector, zodat de kracht van de zwaartekracht kan piconewton-range kra....

Discussie

Bij het omzetten van een film naar een digitaal thresholded voorstelling, is het cruciaal voor de thresholded afbeelding om het hetzelfde gebied in elk frame van de video te behouden. Omdat de kralen in een kraal paar bewegen onafhankelijk van elkaar, kan een eventuele verschuiving in de thresholded gebieden ook de oorzaak van de relatieve afstanden tussen de hartlijnen van de kralen te drijven en de invoering van belangrijke fouten. Het beheersen van de drempel gebied verminderde de fout vijfvoudige in de verte metinge.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
3-Aminopropyltriethoxysilaan	Polysciences, Inc.	919-30-2
Aceton	Fisher Scientific	A18P-4
Pyridine	Sigma-Aldrich	110-86-1
Glutaaraldehyde	Fisher Scientific	G7776
Glycine	Research Organics	BP381-1
Tris	Sigma-Aldrich	9682T
Natriumazide	Amresco	71289
BSA	Sigma-Aldrich	AMR-0332-100G
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
EDTA	MSI	E9884
Nitrocellulose	Sigma-Aldrich	60443
N,N-Dimethylformamide	Extracted from Large New	D4254
Skeletale myosin II van konijn	Zeelandse Witte Konijnen (7-8)	NA
MF30-antilichaam (9-10)	Developmental Studies Hybridoma Bank	MF30
MF20-antilichaam (6)	Hybridoma Bank	MF20
Laboratoriummicroscoop	Boreal	WW57905M00
Equatoriale montering	Celestron	CG-5
Digitale videocamera	Sony Corporation	XCDV60
Schuifmaatsysteem	Cabelas	IA-415482
Drukveer	Jones Spring Co.	723
Trekveer	Jones Spring Co.	770
ImageJ	National Institutes of Health	NA
Fire-i drivers & applicatie	Unibrain	3.80
Excel	Microsoft	NA