Demonstratie van het gebruik van de Novel zwaartekracht Spectrometer te rekken en te meten Stapel-eiwitten

Samenvatting

Dit is een stap-voor-stap handleiding toont het doel, de werking, en representatieve resultaten van de roman zwaartekracht spectrometer.

Samenvatting

De studie van macromoleculaire structuur is geworden van cruciaal belang voor het ophelderen van de moleculaire mechanismen en functie. Er zijn verschillende beperkte, maar belangrijke bioinstruments geschikt voor het testen van de kracht afhankelijkheid van structurele kenmerken in eiwitten. Schaal is een beperkende parameter over hoe nauwkeurig onderzoekers kunnen peer in de nanomechanical wereld van moleculen, zoals nucleïnezuren, enzymen, en de motor eiwitten die levensverlengend werken uit te voeren. Atomaire kracht microscopie (AFM) is goed afgestemd op eigen structuren van de vezelachtige eiwitten te bepalen met een resolutie van afstand op gelijke voet met elektronenmicroscopie. Echter, in AFM kracht studies, de krachten zijn meestal veel hoger dan een enkel molecuul kan ervaring ^{1, 2.} Optische vallen (OT) zijn erg goed in het bepalen van de relatieve afstand tussen de kralen opgesloten en ze kunnen overbrengen zeer kleine krachten ^3. Echter, ze niet toegeven accurate absolute lengte van de moleculen onder studie. Moleculaire simulaties geven ondersteunende informatie om dergelijke experimenten, maar zijn beperkt in de mogelijkheid om het dezelfde grote moleculaire afmetingen, lange tijd frames, handvat en overtuigen sommige onderzoekers in de afwezigheid van andere bewijsstukken ^{2, 4.}

De zwaartekracht spectrometer (GFS) vult een kritische niche in het arsenaal van een onderzoeker door middel van een unieke combinatie van vaardigheden. Dit instrument is in staat om het genereren van krachten meestal met 98% of beter nauwkeurigheid van de femtonewton reeks tot de nanonewton bereik. De afstand metingen op dit moment in staat zijn om het oplossen van de absolute moleculaire lengte tot vijf nanometer, en de relatieve kraal paar afstanden met een precisie die vergelijkbaar met een optische val. Ook kan het GFS bepalen uitrekken of afrollen waar de kracht ligt in de buurt evenwicht, of een gegradeerde kracht om naast elkaar tegen alle gemeten structurele veranderingen. Het is zelfs mogelijk om te bepalen hoeveel aminozuur residuen zijn betrokken bij het ​​afrollen gebeurtenissen onder fysiologische kracht belastingen ^2. In tegenstelling tot in andere methoden waar sprake is van een uitgebreide kalibratie van kracht dat elke test moet voorafgaan, de GFS vereist geen zo'n kracht kalibratie ^5. Door het aanvullen van de sterke punten van andere methoden, zal het GFS brug hiaten in het begrijpen van de Nanomechanica van vitale eiwitten en andere macromoleculen.

Protocol

Inleiding tot de Novel GFS-configuratie

Het GFS bestaat uit een aantal essentiële onderdelen: Een regelmatige lichtmicroscoop, een equatoriale montering, een camera en een computer [Figuur 1]. De verzegelde flow-cell kamer die het monster houdt is ook onmisbaar op basis van de GFS ontwerp. Het Licht microscoop is gemonteerd op de equatoriale montering, zodat de ruimte kan worden gedraaid in verschillende oriëntaties in de ruimte. Dit vermogen kan de statische vector van de zwaartekracht worden benut, zodat de monsters kunnen dynamisch georiënteerd zijn ten opzichte van de vector, zodat de kracht van de zwaartekracht kan piconewton-range kracht ladingen geven aan de monsters. De camera vervangt de licht microscoop oculair lens, zodat het kan opnemen veranderingen in de oriëntatie van het monster. Deze ruwe data wordt gedigitaliseerd en gemanipuleerd door de computer om de gegevens te interpreteren in de werkelijke kracht en de afstand metingen. De verzegelde flow-kamer is ontworpen om alle graden van vrijheid in de ruimte toe te laten zonder monster verlies. In de kamer bevindt zich het monster molecule die in de buurt een eindstation vastgebonden aan een 'anker' kraal die is gelijmd aan het oppervlak van de kamer. Het tegenovergestelde eindpunt is gebonden aan een "mobiele" kraal die vrij is van de oppervlakte van de kamer. Het is deze mobiele kraal, vrij in de assay buffer die kan worden gehandeld bij de door de zwaartekracht waardoor het strekken van de vastgebonden molecuul bij zulke lage kracht belastingen [figuur 2]. Het monster ziet er gewoon als een paar van microsferen onder de microscoop, hoewel het wel enige ervaring te nemen om goede bruikbare paren gekoppeld door hun gehechtheid aan een molecuul van paren waar beide kralen zitten op het oppervlak van de flow-kamer te onderscheiden. Een wijziging in het systeem is de toevoeging van een drijvend platform dat de GFS bezit en is geschorst door veren. In deze configuratie, nadat het monster is gedraaid in een positie waar de zwaartekracht kan optreden op het monster, kan het platform en alle componenten laten vallen tegen de veer constant. De buurt van vrije val, de kracht die op de mobiele kraal is dicht bij nul en bij een maximale uitbreiding van de bronnen ', de zwaartekracht wordt vermenigvuldigd met maar liefst twee keer. Op deze manier kan een gegradeerde kracht / afstand reactie worden getekend om het gedrag van een enkel molecuul bij verschillende belastingen van kracht te meten.

1. Microsfeer Voorbereiding

1. Dompel ongeveer 10 mg van het glas of silica kralen in 0,04% 3-aminopropyltriethoxysilaan (cut met aceton) voor twee minuten.
2. Spoelen met twee wijzigingen van dubbel gedestilleerd water en centrifuge om pellet bij 2000 XG gedurende 5 minuten. Gooi supernatant.
3. Voeg 5 mL van de koppeling buffer (0,01 M pyridine gesneden met dubbel gedestilleerd water en pH tot 6,0 te passen), en schud dit mengsel. Centrifuge zoals hierboven beschreven. Herhaal deze stap drie keer.
4. De natte cake van kralen, voeg 2 ml van 5% gluteraldehyde oplossing (gesneden gluteraldehyde met koppeling buffer). Schud krachtig.
5. Onder een kap, draait kraal / gluteraldehyde mengsel gedurende 3 uur bij kamertemperatuur.
6. Centrifugeer zoals hierboven en zuig het supernatant.
7. Was de kralen in 5 ml van de koppeling buffer door schudden ze krachtig en centrifuge en zuig het supernatant. Herhaal dit drie keer meer.
8. Voeg ongeveer 15 pi van het gewenste antilichaam aan kralen en schud krachtig. De kralen moeten worden gedraaid gedurende 16-24 uur.
9. Onder de motorkap, voeg 5 ml van 1 M glycine quenching-oplossing (cut glycine met dubbel gedestilleerd water en pH tot 7,0 te passen). Schud dit mengsel en draai voor 30 minuten.
10. Centrifugeer en zuig het supernatant.
11. Voeg 5 ml wasbuffer (0,01 M Tris, pH 7,0; 0,1% natriumazide, 0,1% BSA, 0,15 M NaCl en 0,001 M EDTA). Krachtig schudden, dit, centrifuge en zuig het supernatant. Herhaal deze stap drie extra keer.
12. Verandering buffer met een laag zout buffer (0,1 M KCl, 0,02 M imidazool, 5 mM MgCl _2, aan te passen aan pH 7,0). Herhaal dit drie keer.

2. Voorbeeld Bevestiging aan Microsferen

1. Neem een ​​kleine hoeveelheid bereide kralen (echter ongeveer 2 pi van elke taart van kralen, als er een grote discrepantie in diameter tussen de partijen, is het voordelig om gebruik rond een 08:01 verhouding van groot tot klein kralen) en ze toe te voegen aan een microcentrifugebuis met assay buffer. Verlagen de concentratie van uw proteïne tot ongeveer 5 uM, met behulp van de assay buffer. Voor te bereiden op zijn minst een totaal volume van 400 ul met inbegrip van de buffer, het eiwit, en de kralen.
2. Draai dit mengsel bij ongeveer 1 RPM voor 3 uur (als het eiwit is te veel opgewonden, zal het aggregaat en onbruikbaar).

3. Slide Kamer Voorbereiding

1. Vacht een dikke microscoopglaasje met 0,01% nitrocellulose (in amylacetaat). Laat deze dia drogen voor ongeveer 10 minuten.
2. Met een scherpe glassnijder, knippen deksel schuiven om zo een kamer te maken. Dit vereist vier stroken glas.
3. Gebruik het feitORY rand van het glas en hark het over een uitstrijkje van vacuüm vet aan beide zijden van de rand.
4. Druk op vet gecoate strips op gedroogde nitrocellulose bedekt dia naar een kader aan te maken op het oppervlak van de dia.
5. Pipetteer ongeveer 2 pl van kraal / eiwitmengsel door te tikken op het oppervlak van pipetter van glas in de doos.
6. Voeg ongeveer 20 tot 400 ul van een laag zout buffer afhankelijk van hoe groot de kamer is.
7. Druk op een dekglas op de top van de box die reeds is voorzien van vacuüm vet om de verzegelde kamer en gebufferd afwerking.
8. Laat glijbaan zitten op een niveau plaats, zodat de kralen hebben ruimschoots de tijd om zich te verankeren aan de nitrocellulose.

4. GFS Data Acquisition

1. Mount slide op GFS podium
2. Controleren wat de GFS camera opnemen en zoeken naar legitieme "kraal paren," waarin de kleine microsfeer is bevestigd nabij de evenaar van de grote microsfeer.
3. Wanneer een potentiële kraal paar is gevonden, gaan door de diepte van de focus te bepalen of de "mobiele" kraal is niet rust op het oppervlak van de dia.
4. Zodra een geschikt paar is geïdentificeerd, noteer hoek mobiele kraal is uit de buurt van d _max (d _max = de maximale afstand tussen de hartlijnen van de gekoppelde microsferen). Verplaats de mogelijkheden in de juiste positie om de video te verwerven.
5. De hoek van slag van het GFS moet voldoende zijn om d _min, d _max, en d _min, die zou kunnen noemen voor de 25-90 graden, afhankelijk van de lengte van het molecuul vast te leggen.
6. RECORD als het paar reist van d _min tot d _max en weer terug naar d _min.
7. Het is een goed idee om ook een film opneemt van de achtergrond, zodat het kan later worden afgetrokken voor analyse.
8. Als het uitvoeren van een GFS drop, terug naar de ruimte om d _max en neem het laten vallen op ten minste 60 frames per seconde. De kritische deel is de eerste oscillatie, maar lange opnametijden kan ook gebruikt worden voor dynamische studie.

5. GFS Data Analysis

1. Transformeren ruwe video in digitaal "thresholded" beeld en uitvoeren macro in ImageJ om het zwaartepunt positie van elke kraal vast te stellen in elk frame van de video. Dit is ook voor de daling video.
2. Dump de X, Y en het gebied van gegevens uit ImageJ in Excel en plot van de punten.
3. Als u een goede kraal paar werd overgenomen door video, een opmerkelijke bult in de grafiek is een indicatie van de kralen worden op hun dichtst (d _min) en aan de top van de grafiek is de positie van d _max.
4. Met behulp van deze gegevens, moet de straal van elke kraal precies te zijn in ImageJ worden bepaald en al deze informatie wordt in de geneste vergelijking:
   d = [(g sin α) ² + (g cos α + d _max - g) ^{2] 0,5}
   g = [d _min ² + r _b ² - (r + r _{een b)} ^{2] 0,5} = r _b sin β
   c = d _max - r _een - g
   (D = afstand tussen de hartlijnen; g = kracht van de zwaartekracht, α = de hoek in graden parallel aan de doelstelling lens; r _b = straal van mobiele kraal, r = straal van _een verankerde kraal; β = hoek van gehechtheid uit de as van de evenaar van de verankerde kraal.
5. Met behulp van de gemonteerd straal van de mobiele kraal, die ook geeft het volume, en gezien de dichtheid van de kraal, de kracht van de mobiele kraal verleent op het molecuul kan worden berekend in picoNewtons na de opwaartse druk van het oplosmiddel is afgetrokken. Deze methode meet de kracht op de vastgebonden molecuul in picoNewtons en berekent de absolute molecuul lengte tussen antilichaam bijlagen in nanometers. F = V (db) een (F = kracht, V = volume, d = dichtheid van het glas microsfeer, a = versnelling gevolg van de zwaartekracht, b = de dichtheid van het verplaatste water).

6. Representatieve resultaten:

Als de kraal prep is dit juist gebeurt, zal er minimaal kraal samenvoeging, hoewel er misschien nog af en toe een kraal klonteren. Wanneer bekeken door de omvang, moet er een redelijke verdeling van de kralen al gepaarde of niet in de kamer.

Het is belangrijk te minimaliseren trillingen zoveel mogelijk, om dit te doen of een lucht-tafel, speciale schokabsorberende voetjes voor een statief dat een EQ monteren bezit, of op het systeem dat gebruik maakt van bronnen kunnen worden gebruikt voor trillingsisolatie.

Een andere nuttige tip met betrekking tot de verzegelde kamer stroom is om het te laten staan ​​voor ongeveer vijf minuten op een niveau van tafel nadat deze volledig is gebouwd. Hierdoor kunnen eventuele losse grotere kralen naar beneden zweven door de buffer en de rest in de laag van nitrocellulose. Als de dia waren in plaats daarvan direct gemonteerd na voltooiing, zou de onderzoeker voortdurend te maken hebben met kralen letterlijk vliegen door het gezichtsveld, en als dit gebeurt tijdens de video-acquisitie kan corrupt ee experiment. Als dit goed wordt gedaan, is kraal vlucht aanzienlijk geminimaliseerd en schoner video resultaten.

Wanneer een potentiële kraal paar is geïdentificeerd door de GFS exploitant, is het nuttig om het gebracht door middel van een eerste rotatie om het gedrag van het paar te controleren. In zeldzame gevallen is de grote kraal niet stevig bevestigd aan de dia. Als dit gebeurt, is er geen gebruik in het benutten van het paar, omdat het is van cruciaal belang dat de grotere kraal verblijf in een vaste positie door de duur van de overname verankerd. Als het paar is stabiel en vertoont niet 'verankerd kraal roll, "dan is het geschikt is voor experimenten.

Een perceel van kraal afstanden ten opzichte van verandering in de hoek ten opzichte van de zwaartekracht kan worden gebruikt om de verkregen gegevens te evalueren. Een goede vertegenwoordiger resultaat zou tonen weinig scheiding op een plateau en als de mobiele kraal bevrijdt zich van de verankerde kraal als gevolg van de invloed van de zwaartekracht, de grafiek zal meer scheiding te kunnen aantonen. Dit gaat door totdat een mooie piek is bereikt, dat heet d _max en de curve naar beneden begint weer terug te keren naar de basislijn d _min [Figuur 1]. In ideale omstandigheden, deze handtekening is symmetrisch. Een niet-representatieve resultaat zou laten zien een grafiek met onsamenhangende patronen toont geen duidelijke d _{min-d max-d min} patroon, of het zou aantonen scheidingen die ordes van grootte te hoog voor een enkel molecuul aangeeft misschien was er een stukje stof tussen de kralen, of misschien dat de mobiele kraal was gewoon helemaal niet bevestigd. Het proces van het vinden van het paar, schieten, verwerken en analyseren van het heeft vele gaten stoppen van misbruik kraal paren worden afgemaakt uit. Dus, als je aan het einde van het gehele proces en je hebt een molecule lengte die in overeenstemming is met eerdere resultaten, kan men er veel vertrouwen in dat de oorspronkelijke kraal paar representatief is en kan worden opgenomen in de resultaten. Op een goede dag, kan ongeveer de helft van de kraal paren schot worden genomen door middel van een legitieme data punt te worden. Zo is de lengte van de opgerolde spoel van myosine tussen MF20 en MF30 antilichamen, bekend op basis van EM-gegevens en de AFM, data tot 100 nm ^2,7,8,9 aanpak. Als het resultaat is een paar keer deze lengte, heeft het monster samengevoegd. De hier gepresenteerde resultaten zijn van de standaard GFS rotatie experimenten en aantonen dat er een afstand van 96 nm ± 5 nm, [figuur 2] die nauw is het eens met de metingen van de MF30 (die bindt aan de N-terminus van myosine subfragment-2) en MF20 (wat bindt in het licht meromyosin) antilichaam afstand op myosine afgeleid uit de literatuur waarden [figuur 3].

Figuur 1. GFS configuratie. Grote delen van het GFS zijn gelabeld.

Figuur 2. Schematische voorstelling van GFS principe. Linkerkant toont zwaartepunt van de mobiele kraal op een minimale afstand van zwaartepunt van verankerd kraal. Omdat GFS is gedraaid, mobiele kraal samenvalt met vector van de zwaartekracht die ook parallel loopt met de as van de vastgebonden molecuul. In deze positie, de afstand tussen de hartlijnen van de mobiele en verankerd kralen is een maximum. Rechts boven ziet u een vertegenwoordiger van een slice GFS film. Rechtsonder is een beeld van het GFS ondergaan rotatie.

Figuur 3 Vertegenwoordiger resultaat dat d _min aan de linkerkant van de grafiek;. D _max bij een relatieve scheiding van 17,78 micron, en een terugkeer naar d _min rond de baseline van ongeveer 17,75 micron van de relatieve afstand tussen de kralen.

Figuur 4. Vertegenwoordiger gevolg van de SBO-rotatie experiment met afstand tussen de MF20 en MF30 antilichamen gemiddeld 96 nm. Dit komt overeen met de lengte van de S2.

Figuur 5. Myosine II dimeer gebruikt om de eventuele bijlagen te tonen voor gebruik met de GFS waaronder antilichaam en / of actine bijlagen. Verschillende bevestiging mogelijkheden biedt voor verschillende GFS strategieën om de verschillende regio's te meten, of om kracht loodrecht parallel toe te passen of de roede domein van de myosine dimeer.

Discussie

Bij het omzetten van een film naar een digitaal thresholded voorstelling, is het cruciaal voor de thresholded afbeelding om het hetzelfde gebied in elk frame van de video te behouden. Omdat de kralen in een kraal paar bewegen onafhankelijk van elkaar, kan een eventuele verschuiving in de thresholded gebieden ook de oorzaak van de relatieve afstanden tussen de hartlijnen van de kralen te drijven en de invoering van belangrijke fouten. Het beheersen van de drempel gebied verminderde de fout vijfvoudige in de verte metinge...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
3-Aminopropyltriethoxysilaan	Polysciences, Inc.	919-30-2
Aceton	Fisher Scientific	A18P-4
Pyridine	Sigma-Aldrich	110-86-1
Glutaaraldehyde	Fisher Scientific	G7776
Glycine	Research Organics	BP381-1
Tris	Sigma-Aldrich	9682T
Natriumazide	Amresco	71289
BSA	Sigma-Aldrich	AMR-0332-100G
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
EDTA	MSI	E9884
Nitrocellulose	Sigma-Aldrich	60443
N,N-Dimethylformamide	Extracted from Large New	D4254
Skeletale myosin II van konijn	Zeelandse Witte Konijnen (7-8)	NA
MF30-antilichaam (9-10)	Developmental Studies Hybridoma Bank	MF30
MF20-antilichaam (6)	Hybridoma Bank	MF20
Laboratoriummicroscoop	Boreal	WW57905M00
Equatoriale montering	Celestron	CG-5
Digitale videocamera	Sony Corporation	XCDV60
Schuifmaatsysteem	Cabelas	IA-415482
Drukveer	Jones Spring Co.	723
Trekveer	Jones Spring Co.	770
ImageJ	National Institutes of Health	NA
Fire-i drivers & applicatie	Unibrain	3.80
Excel	Microsoft	NA