Passage menselijke neurale stamcellen

Summary

De mogelijkheid om menselijke neurale stamcellen / precursor cellen (hNSPCs) te manipuleren in vitro het mogelijk maakt om hun bruikbaarheid te onderzoeken als cel transplantatie voor therapeutische doeleinden en voor de menselijke ontwikkeling van het zenuwstelsel te verkennen. Dit protocol bevat een methode voor het kweken en de passage hNSPCs in de hoop van de toenemende reproduceerbaarheid van het menselijk stamcelonderzoek.

Abstract

De mogelijkheid om menselijke neurale stamcellen / precursor cellen (hNSPCs) te manipuleren in vitro biedt een middel om hun bruikbaarheid te onderzoeken als cel transplantatie voor therapeutische doeleinden, alsmede voor vele fundamentele processen van de menselijke neurale ontwikkeling en pathologie te verkennen. Dit protocol biedt een eenvoudige methode van het kweken en de passage hNSPCs in de hoop de standaardisering van deze techniek en het vergroten van de reproduceerbaarheid van het menselijk stamcelonderzoek. De hNSPCs we gebruiken werden geïsoleerd uit dode postnatale hersenen cortex door de Nationale menselijke neurale stamcellen Resource en gegroeid als aanhanger culturen op flessen bekleed met fibronectine (Palmer et al., 2001;.. Schwartz et al., 2003). We cultuur onze hNSPCs in een DMEM: F12 serum-vrij medium aangevuld met EGF, FGF, en PDGF en passage hen 01u02 ongeveer om de zeven dagen. Met behulp van deze voorwaarden, de meerderheid van de cellen in de cultuur te behouden een bipolaire morfologie en uitdrukkelijke markers van ongedifferentieerde neurale stamcellen (zoals Nestin en Sox2).

Protocol

Opmerking: Voor routine kweken van onze hNSPCs, veranderen we 50-100% van de media om de andere dag en meestal passage hen 01u02 een keer per week. De cultuur media bevat 20% BIT-9500, 1X antibiotica / antimycotica, en groeifactoren (EGF, FGF, PDGF en elk bij 40 ng / ml) in DMEM: F12 base media.

De voorbereiding van de Coated kolf en Dissociatie de Cellen

1. Om nieuwe kolven voor te bereiden op de passage cellen, jas T25 flessen met 10 ug / ml humaan fibronectine in EMEM gedurende 4 uur of 's nachts, in een 37 ° C weefselkweek incubator. Vlak voor passage van de cellen, verwijder de fibronectine-oplossing en spoel de k....

Discussion

We hebben ontdekt dat dit protocol een betrouwbare culturen van hNSPCs biedt. Een kritische factor voor onze cellen is dat ze moeten worden gehouden als tamelijk dicht culturen en kan niet worden gepasseerd om het punt dat de cellen schaars zijn. In onze handen, dun culturen groeien heel langzaam of helemaal niet meer te delen. Om deze reden hebben we doorgaans verdeeld onze culturen 1:2 of 1:3 als een cultuur is zeer dicht. Coating het oppervlak van een cultuur schotel met fibronectine is belangrijk, want het bevordert een goede celhechtin.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BIT-9500 (BSA, Insulin, Transferrin)	Reagent	Stem Cell Technologies	09500
Antibiotic-Antimycotic	Reagent	Invitrogen	15240-062
DMEM:F12 (1X)	Reagent	Invitrogen	11330-032
EMEM (1X)	Reagent	Mediatech, Inc.	MT-10-010-CV	Distributed by Fisher under the indicated catalog #
Fetal Bovine Serum	Reagent	Invitrogen	10437-028
FGF, human basic recombinant	Reagent	PeproTech Inc	100-18B
PDGF-AB	Reagent	PeproTech Inc	100-00AB
EGF, human recombinant	Reagent	BD Biosciences	CB40052	Distributed by Fisher under the indicated catalog #
Cell Culture Flask, 25 cm2	Tool	Corning	10-126-28	Distributed by Fisher under the indicated catalog #
Fibronectin, human, natural	Reagent	BD Biosciences	CB40008A	Distributed by Fisher under the indicated catalog #
Human Neural Stem/Precursor Cells	Cells	National Human Neural Stem Cell Resource
Cell Dissociation Buffer	Reagent	Invitrogen	13150-016