De subcellulaire lokalisatie van eiwitten is belangrijk bij het bepalen van de spatio-temporele regulatie van cell signaling. We beschrijven hier bimoleculaire fluorescentie complementatie (BiFC) als een eenvoudige methode voor het bewaken van de ruimtelijke interacties van eiwitten in de cel.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het definiëren van de subcellulaire distributie van signalering complexen is absoluut noodzakelijk om het begrijpen van de uitvoer van dat complex. Conventionele methoden zoals immunoprecipitatie geen informatie geven over de ruimtelijke lokalisatie van complexen. In tegenstelling, BiFC controleert de interactie en subcellulaire compartimentering van eiwitcomplexen. In deze methode wordt een fluororescent eiwit te splitsen in amino-en carboxy-terminale niet-fluorescerende fragmenten die vervolgens worden gefuseerd met twee eiwitten van belang. Interactie van de eiwitten resulteert in een reconstructie van de fluorofoor (Figuur 1) 1,2. Een beperking van BiFC is dat zodra de gefragmenteerde fluorofoor is gereconstitueerd het complex is onomkeerbaar 3. Deze beperking is voordelig bij het opsporen van voorbijgaande of zwakke interacties, maar verzet zich tegen een kinetische analyse van complexe dynamiek. Een bijkomend nadeel is dat het opgeloste flourophore vereist 30min om te rijpen en fluoresceren, opnieuw verzet tegen de observatie van real-time interactie 4. BiFC is een specifiek voorbeeld van het eiwit fragment invulling assay (PCA), die reporter eiwitten zoals groen fluorescerend eiwit varianten (BiFC), dihydrofolaatreductase, b-lactamase, en luciferase om eiwitten te meten telt: eiwit interacties 5,6. Alternatieve methoden voor eiwit bestuderen: eiwit interacties in cellen op te nemen fluorescentie co-localisatie en Förster resonance energy transfer (FRET) 7. Voor co-localisatie, zijn twee eiwitten individueel, hetzij direct gelabeld met een fluorofoor of door indirecte immunofluorescentie. Echter, deze benadering leidt tot een hoge achtergrond van niet-interagerende eiwitten waardoor het moeilijk is om co-localisatie gegevens te interpreteren. Daarnaast is te wijten aan de grenzen van de resolutie van confocale microscopie, kan twee eiwitten lijken co-gelokaliseerde zonder dat interactie. Met BiFC, wordt fluorescentie alleen waargenomen wanneer de twee eiwitten van belang met elkaar omgaan. FRET is een uitstekende methode voor het bestuderen eiwit: eiwit interacties, maar kan technisch gezien een uitdaging. FRET experimenten vereisen de donor en acceptor te worden van dezelfde helderheid en stoichiometrie in de cel. Bovendien moet een account voor bloeden door van de donor naar de acceptor kanaal en vice versa. FRET in tegenstelling tot, BiFC heeft weinig achtergrond fluorescentie, paaltje verwerking van de beeldgegevens, vereist geen hoge overexpressie, en kan detecteren zwakke of voorbijgaande interacties. Bioluminescentie resonantie energie-overdracht (BRET) is een methode lijkt op FRET, behalve de donor is een enzym (bijv. luciferase) dat een substraat katalyseert te worden bioluminescente zo spannend een acceptor. BRET mist de technische problemen van bloeden door en hoge achtergrond fluorescentie maar mist de mogelijkheid om ruimtelijke informatie te verstrekken door het ontbreken van substraat lokalisatie van specifieke compartimenten 8. Over het geheel genomen BiFC is een uitstekende methode voor het visualiseren van subcellulaire lokalisatie van eiwitcomplexen om inzicht te krijgen in gecompartimenteerde signalering.
Protocol
A. BiFC Kalibratie
- Kies een fluorofoor. Er zijn meerdere fluoroforen, zoals YFP en Venus, die goed werken als BiFC fusiepartners (tabel 1). Amino-en carboxy-terminale uiteinden van Venus in staat zijn om een complexe vorm bij 37 ° C, terwijl de YFP BiFC fragmenten vereisen een pre-incubatie bij 30 ° C om de vorming fluorofoor 2 te vergemakkelijken. Deze incubatie bij een lage temperatuur kunnen veranderen sommige cellulaire processen en moet rekening worden gehouden bij de keuze van fragmenten. Vectoren voor fusing Venus aan het carboxy-terminus van eiwitten zijn verkrijgbaar bij Addgene ( http://www.addgene.org/pgvec1 , seepBiFC-VN173 en pBiFC-VC155) samen met extra constructies voor gebruik als controle, bijvoorbeeld pBiFC-bJunVN173 en pBiFC-bFosVC155 2. Extra vectoren, met inbegrip van amino-terminal Venus vectoren (pFLAG-VN173 en Pha-VC155), zijn beschikbaar op de volgende site: http://people.pnhs.purdue.edu/ ~ hu1 / .
- Tag het eiwit van belang. BiFC fragmenten zijn gefuseerd aan het amino-of carboxy-terminale uiteinden van de kandidaat-eiwitten. Sommige eiwitten kunnen niet toestaan dat voor tagging aan beide uiteinden te wijten aan verstoring van de eiwit-functie. Bijvoorbeeld, veel leden van de Ras superfamilie van GTPases zijn lipide aangepast aan het carboxy-uiteinde waardoor elke bevestiging van de BiFC fragmenten aan dat uiteinde. Het is dus belangrijk om een idee van hoe de bevestiging van het BiFC fragmenten kunnen functie van de eiwitten van belang wordt geschaad. Als het onduidelijk is hoe tagging een eiwit invloed zal zijn functie meerdere combinaties moeten worden getest. In aanvulling op de BiFC fragment, kan een peptide linker worden opgenomen om de flexibiliteit tussen de gefragmenteerde fluorofoor en de kandidaat-eiwitten te verhogen. Terwijl de meervoudige kloneringsplaatsen (MCS) in de BiFC vectoren coderen korte aminozuur strekt zich uit dat er voldoende flexibiliteit, de RSIAT, KQKVMNH en RPACKIPNDLKQKVMNH koppelaars kunnen zijn met succes toegepast in BiFC experimenten 3,9
- Bepaal transfectie voorwaarden. Voordat het testen van meerdere mutanten, een paar controle-experimenten moeten worden uitgevoerd. De eerste twee BiFC combinaties die moeten worden berecht zijn twee wild-type eiwitten waarvan bekend is dat samen te werken en een wild-type en mutant die niet op elkaar inwerken. Met behulp van deze twee combinaties, moeten verschillende hoeveelheden DNA en transfectie tijden worden getest om optimale voorwaarden te bepalen voor het detecteren van een BiFC signaal voor de kandidaat-eiwitten. Wij stellen voor het testen van 0.25ug, 0.5ug, 1.0ug van elk BiFC bouwen voor een goed van een zes goed gerecht. De dag na transfectie controleren cellen met behulp van fluorescentie microscopie om een optimale tijd te bepalen voor het signaal ontwikkeling. De pBiFC-bJunVN173 en pBiFC-bFosVC155 twee constructen positieve en nuttige controles voor BiFC en zijn verkrijgbaar bij Addgene (zie hierboven). Daarnaast moet Western blot-analyse worden uitgevoerd om gelijk de expressie van de constructen te bevestigen. Voorwaarden moeten worden gekozen dat een fluorescerend signaal wordt waargenomen tussen de twee wild-type eiwitten, maar weinig tot geen signaal is waargenomen tussen de wild-type en mutant eiwitten. Tot slot is het best om eiwitexpressie te houden zo laag mogelijk op elke niet-specifieke interacties te voorkomen.
- Te bepalen of de toevoeging van de BiFC fragmenten verandert de lokalisatie van de eiwitten van belang. BiFC Elke constructie bevat ofwel een HA-of vlag epitoop-tag. Immunostain transefected cellen voor zowel de HA of het FLAG-epitoop-tag en ook de endogene eiwit (indien mogelijk) om te bepalen of de BiFC tag van invloed op de lokalisatie van de eiwitten van belang.
B. Plating en transfectie van cellen
- COS-cellen (1.3x10 5) zijn geplateerd ieder op een glazen bodem Matek plaat en twee putjes van een 6-wells plaat per monster. Laat cellen om 's nachts af te wikkelen bij 37 ° C. Alternatief celtypen die meer relevant zijn voor de kandidaat-eiwitten van belang kunnen ook worden gebruikt.
- Bereid DNAs voor transfectie. We meestal gebruik maken van Lipofectamine (Invitrogen) voor COS transfecties. Echter, kunnen andere reagentia worden meer geschikt voor de cellijn van belang. Sinds de transfectie mengsel zal worden verdeeld tussen een glazen bodem schotel en twee putjes van een 6-wells plaat, gebruik maken van de juiste hoeveelheid DNA om rekening te houden voor deze divisie. Verdunnen DNA in 250uL van serum vrij (SF) DMEM. Voeg GVB op 1 / 5 van de totale hoeveelheid BiFC DNA als een transfectie controle. Voor BiFC kwantificering, zullen alleen cellen die positief zijn voor het GVB worden geanalyseerd op de aanwezigheid van een BiFC signaal. Merk op dat het GVB spectra zullen overlappen met sommige van de BiFC paren in tabel 1, en daarom een alternatief transfectie controlemisschien nodig is. Verdunnen Lipofectamine in 250uL SF DMEM (10uL Lipofectamine/1ug van DNA). Meng de DNA en Lipofectamine verdunningen. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20min.
Opmerking: De Lipofectamine: DNA-verhouding kan variëren, afhankelijk van het celtype. Gebruik de juiste transfectie methode voor de cellijn van belang. - Spoel cellen 2x met warm SF DMEM. Voeg 2 ml van de SF DMEM aan elke glazen bodemplaat of goed van een 6-well schotel.
- Gelijkmatig verdeeld elke transfectie mix tussen een glazen bodem schotel en twee putjes van een 6-well schotel.
- Incubeer cellen bij 37 ° C voor 5 uur.
- Verwijder transfectie media en te vervangen door volledige media (DMEM + 10% FBS).
- Incubeer cellen een nacht bij 37 ° C. De lengte van de incubatietijd na transfectie zal variëren afhankelijk van de expressie van de eiwitten van belang. Langdurige incubatie kan leiden tot niet-specifieke interactie, dus deze stap moet empirisch worden bepaald.
C. Voorbereiding van de Cellen voor Imaging
- Cellen zijn in eerste instantie onderzocht onder een microscoop epifluorescerende om ervoor te zorgen dat de positieve controle fluorescerende is. Zo niet, dan kan het nodig zijn om cellen extra tijd te geven bij 37 ° C totdat het signaal wordt waargenomen.
- Spoel cellen 3x met PBS (pH 7,4). Om de cellen in de glazen bodem schaal toe te voegen 2% paraformaldehyde (pH 7,4). Fix-cellen voor 10 min. op ijs. Spoel cellen 3x met PBS (pH 7,4). Bewaar de cellen bij 4 ° C bedekt met 1 ml PBS (pH 7,4). Cellen hoeven niet te worden vastgesteld voor beeldvorming, maar zodra de BiFC fragmenten hervorming een intact fluorofoor het is onomkeerbaar dus voorkomen dat de analyse van dynamische interacties 3. Houd er ook rekening mee dat niet vastgelegde cellen zal blijven signaal te ontwikkelen. Lyseren van de cellen in de 6-well schotel en voor te bereiden lysaten voor Western blot analyse. Het is belangrijk dat alle cellen zijn bereid op hetzelfde moment, zodat de cellen gelyseerd representatief zijn voor de verbeelde cellen.
D. Imaging Cellen
- De fluorescentie-intensiteit wordt berekend per cel. Zorg ervoor dat u beeld individuele cellen.
- GVB was opgenomen als een tranfection controle en alleen GVB-positieve cellen worden geselecteerd voor de analyse van BiFC signalen. We maken de veronderstelling dat als de cel wordt getransfecteerd met het GVB, het is ook getransfecteerd met de BiFC constructen. Deze aanpak zorgt ervoor dat afgebeeld cellen die een signaal BiFC gebrek aan negatief zijn te wijten aan een gebrek aan een interactie tussen de eiwitten van belang en niet door het ontbreken van een of beide BiFC expressie constructen in die cel.
- We maken gebruik van een Zeiss LSM 510 confocale microscoop voor cell imaging. Bij het gebruik van deze microscoop is het belangrijk om de zoom, pinhole, detector te verkrijgen, versterker offset, frame grootte, scansnelheid, scan gemiddelde en laservermogen consistent. Bij het gebruik van een imaging systeem is het belangrijk om constant de instellingen, zodat de fluorescentie is vergelijkbaar tussen de monsters. Ook wanneer het kwantificeren van fluorescentie is het belangrijk dat pixels niet verzadigd zijn.
E. Het kwantificeren van Fluorescentie
- Fluorescentie kan worden gekwantificeerd met behulp van een imaging-software. Wij gebruiken ImageJ dat is vrij verkrijgbaar bij de NIH (http://rsb.info.nih.gov/ij/). Beeldbestanden opent in ImageJ. Ga naar AnalyzeSet Metingen. Vink de vakjes voor Ruimte en gemiddelde grijswaarde in het Parameter-box.
- Met behulp van gereedschap van de "vrije hand selectie ', tekenen een omtrek rond de rand van de hele cel in het GVB-kanaal.
- Het verlaten van dit overzicht in de plaats, verschuiving naar de YFP kanaal. Ga naar AnalyzeMeasure.
De gemiddelde grijswaarde is de som van de grijswaarden van alle pixels in de selectie, gedeeld door het aantal pixels (dat wil zeggen, de gemiddelde fluorescentie-intensiteit per oppervlakte van de cel). - Voor elk beeld trek een cirkel in de YFP-kanaal in een gebied dat niet bevat een cel. Neem een maat voor dit gebied als achtergrond. Trek de achtergrond van elk beeld.
- Het gemiddelde van de gemiddelde grijswaarde minus de achtergrond voor alle cellen afgebeeld in een monster. Dit zal de gemiddelde fluorescentie-intensiteit voor een bevolking van cellen. Wij stellen voor ongeveer 60 cellen over drie experimenten worden gekwantificeerd.
F. representatieve resultaten:
Ons lab richt zich op de multi-domein steigers eiwit, intersectin (ITSN), die samenwerkt met een groot aantal eiwitten te reguleren meerdere biochemische en signaalwegen 10,11,12,13,14. ITSN bevat twee EPS 15 homologie (EH) domeinen, een opgerolde-opgerolde regio, en vijf Src homologie 3 (SH3) domeinen. De langere isovorm van ITSN bevat ook Dbl homologie (DH) en pleckstrin homologie (PH) domeinen die in onderling overleg optreden als een guanine nucleotide ruil factor voor Cdc42 15. Deze modulaire structuur bevordert eiwit: eiwit interacties en maakt ITSN een ideale kandidaat voor BiFC experimenten. De subcellulaire lokalisatie van ITSN kan veranderen zijn binding partners en dus veranderen de paden gereguleerd door ITSN (unpublisHed gegevens). Onlangs heeft ons lab aangetoond dat ITSN neuronale overleving regelt door middel van regulering van een nieuwe klasse II PI3K, PI3K-C2β 11. De amino-terminale Pro-rijke domein van PI3K-C2β bevat twee bindingsplaatsen voor ITSN is SH3 domeinen. Met behulp van co-immunoprecipitatie met ITSN en PI3K-C2β truncation mutanten hebben we aangetoond dat ITSN is SH3A en SH3C domeinen interactie met de amino-terminale gebied van PI3K-C2β. Vervolgens gebruikten we BiFC om de subcellulaire lokalisatie van dit complex te visualiseren. ITSN was gefuseerd met de amino-terminus van Venus (pFLAG-VN173) en PI3K-C2β constructies gefuseerd aan het carboxy-terminus van Venus (PHA-VC155). Een ander negatieve controle werd een niet-specifieke peptide gefuseerd aan PHA-VC155. VN-ITSN en VC-PI3K-C2β vormden een BiFC complex met een accentueren distributie (figuur 2A, bovenste panelen). Mutaties in de Pro-rijke domein van PI3K-C2β dat co-precipitatie van ITSN en PI3K-C2β verstoren verlaagde de BiFC signaal (figuur 2A, onderste panelen) 11. Dit verschil in BiFC signaal tussen ITSN en de twee PI3K-C2β eiwitten was niet te wijten aan verschillen in eiwit-expressie (Figuur 2B).
. Figuur 1 In BiFC, is een fluorofoor (in dit geval Venus) te splitsen in aminozuren (VN) - en carboxy (VC)-terminal eindigt. Deze uiteinden zijn gefuseerd met twee eiwitten van belang. Toen de twee eiwitten interageren, de VN en VC fragmenten opnieuw koppelen resulteert in herstel van de fluorofoor en fluorescentie bij de sites van interactie. BiFC is een specifiek voorbeeld van het eiwit fragment invulling assay (PCA) gebruikt om het proteïnegehalte te meten:-eiwit interacties 5.
Figuur 2. ITSN en PI3K-C2β vormen een BiFC complex. A. VN-gelabeld ITSN was co-tranfected met VC-gelabeld PI3K-C3β WT of een proline-rijk domein mutant (PI3K-C2β-PA). ITSN en WT PI3K-C2β vormen een complex (groen). GVB (rood) werd gebruikt als een transfectie controle B. Een Western blot werd uitgevoerd op gelijke expressie van de constructen te tonen. De VC-gemerkte constructen HA gelabeld.
Tabel 1. Er zijn meerdere vectoren die compatibel zijn met BiFC. YN155: 1-155aa van YFP, YC155: 155-238aa van YFP, YN173: 1-172aa van YFP, YC173, 173-238aa van YFP, VN155: 1-154aa van Venus; VC155: 155-238 van Venus; VN173: 1-172aa van Venus; VC173: 173-238aa van Venus, een CN155-154aa van het GVB; CC155 155-238aa van het GVB, GN173: 1-172aa van GFP, CitN155: 1-155aa van Citrien, CitC155: 155-238aa van Citrien, CitN173: 1-172aa van Citrien, CitC173: 173-238aa van Citrien, CerN173: 1-172aa van Cerulean 2,3,9.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
BiFC is een uitstekende methode voor het visualiseren van eiwit: eiwit interacties in hele cellen en het bepalen van de subcellulaire lokalisatie van deze complexen. De voordelen van BiFC zijn dat alleen interagerende eiwitten fluorescent zijn, zijn van voorbijgaande aard interacties gestabiliseerd, en post-verwerking van de beeldgegevens is minimaal. Twee nadelen van deze methode zijn de rijping tijd voor de fluorofoor en de onomkeerbaarheid van fluorofoor complex. Onder sommige toepassingen is deze onomkeerbaarheid ka...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
De ITSN, PI3K-C2β, en controle vectoren die in dit protocol zijn verkrijgbaar bij de auteurs op verzoek, voor niet-commerciële doeleinden. De auteurs willen dr. Chang-Deng Hu te erkennen voor het vriendelijk advies en de reagentia die worden gebruikt bij het vaststellen van de BiFC protocol in de O'Bryan laboratorium. KAW werd ondersteund door financiële steun van de Stichting Jerome Lejeune. Werk in het laboratorium O'Bryan wordt ondersteund door subsidies van de NIH (HL090651), DOD (PR080428), de St. Baldrick's Foundation, en de Stichting Jerome Lejeune.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| DMEM | Cellgro | 10-013 | |
| Foetaal runderserum | Cellgro | 35-011-CV | |
| Microwell-schoteltjes met glazen bodem | Matek | P35G-1.5-14C | |
| 6-wells schoteltjes | Falcon BD | 35-3846 | |
| Lipofectamine | Invitrogen | 18324020 | |
| PBS | Cellgro | 21-031-CV | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Confocale microscoop | Carl Zeiss, Inc. | LSM510 META |
Referenties
- Kerppola, T. K. Visualization of molecular interactions by fluorescence complementation. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 449-456 (2006).
- Shyu, Y. J., Liu, H., Deng, X., Hu, C. D. Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions. Biotechniques. 40, 61-66 (2006).
- Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol Cell. 9, 789-798 (2002).
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Michnick, S. W., Remy, I., Campbell-Valois, F. X., Vallee-Belisle, A., Pelletier, J. N. Detection of protein-protein interactions by protein fragment complementation strategies. Methods Enzymol. S328, 208-230 (2000).
- Michnick, S. W., MacDonald, M. L., Westwick, J. K. Chemical genetic strategies to delineate MAP kinase signaling pathways using protein-fragment complementation assays (PCA). Methods. 40, 287-293 (2006).
- Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends Biochem Sci. 32, 407-414 (2007).
- Ciruela, F. Fluorescence-based methods in the study of protein-protein interactions in living cells. Curr Opin Biotechnol. 19, 338-343 (2008).
- Hu, C. D., Kerppola, T. K. Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis. Nat Biotechnol. 21, 539-545 (2003).
- Martin, N. P. Intersectin regulates epidermal growth factor receptor endocytosis, ubiquitylation, and signaling. Mol Pharmacol. 70, 1643-1653 (2006).
- Das, M. Regulation of neuron survival through an intersectin-phosphoinositide 3'-kinase C2beta-AKT pathway. Mol Cell Biol. 27, 7906-7917 (2007).
- Mohney, R. P. Intersectin activates Ras but stimulates transcription through an independent pathway involving. JNK. J Biol Chem. 278, 47038-47045 (2003).
- Tong, X. K., Hussain, N. K., Adams, A. G., O'Bryan, J. P., McPherson, P. S. Intersectin can regulate the Ras/MAP kinase pathway independent of its role in endocytosis. J Biol Chem. 275, 29894-29899 (2000).
- Adams, A., Thorn, J. M., Yamabhai, M., Kay, B. K., O'Bryan, J. P. Intersectin an adaptor protein involved in clathrin-mediated endocytosis, activates mitogenic signaling pathways. J Biol Chem. 275, 27414-27420 (2000).
- O'Bryan, J. P., Mohney, R. P., Oldham, C. E. Mitogenesis and endocytosis: What's at the INTERSECTIoN? Oncogene. 20, 6300-6308 (2001).
- Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. Visualization of AP-1 NF-kappaB ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 151-156 (2008).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
