Een techniek wordt beschreven om de in vivo fysiologische reactie van zoogdieren neuronen tijdens beweging kwantificeren en de fysiologie van het neuron met neuronale morfologie, fenotype neurochemische en synaptische microcircuits correleren.
Methodenartikel
Een techniek wordt beschreven om de in vivo fysiologische reactie van zoogdieren neuronen tijdens beweging kwantificeren en de fysiologie van het neuron met neuronale morfologie, fenotype neurochemische en synaptische microcircuits correleren.
De rol van individuele neuronen en hun functie in neuronale circuits is fundamenteel voor het begrijpen van de neuronale mechanismen van sensorische en motorische functies. De meeste onderzoeken van sensorimotorische mechanismen beroepen op onderzoek van neuronen, terwijl een dier is statisch 1,2 of neem extracellulaire neuronale activiteit tijdens een beweging. 3,4 Hoewel deze studies hebben de fundamentele achtergrond voor sensomotorische functie, ofwel ze geen functionele informatie te evalueren die optreedt tijdens een beweging of zijn beperkt in hun mogelijkheden om volledig te karakteriseren van de anatomie, fysiologie en neurochemische fenotype van het neuron. Een techniek is hier te zien die het mogelijk maakt een uitgebreide karakterisering van de individuele neuronen tijdens een in-vivo-beweging. Deze techniek kan niet alleen gebruikt worden om de primaire afferente neuronen bestuderen, maar ook om motoneuronen en sensomotorische interneuronen te karakteriseren. Aanvankelijk was de reactie van een enkel neuron is geregistreerd met behulp van elektrofysiologische methoden tijdens de verschillende bewegingen van de onderkaak, gevolgd door de bepaling van het receptieve veld voor de neuron. Een neuronale tracer is vervolgens intracellulair geïnjecteerd in de neuron en de hersenen is zo bewerkt dat het neuron kan worden gevisualiseerd met licht, elektronen of confocale microscopie (afb. 1). De gedetailleerde morfologie van het neuron gekenmerkt wordt vervolgens gereconstrueerd, zodat neuronale morfologie kan worden gecorreleerd met de fysiologische reactie van het neuron (afb. 2,3). In deze mededeling belangrijke sleutel details en tips voor een succesvolle implementatie van deze techniek zijn voorzien. Waardevolle aanvullende informatie kan worden bepaald voor de neuron onder studie door het combineren van deze methode met andere technieken. Retrograde neuronale de etikettering kunnen worden gebruikt om de neuronen te bepalen met welke de gelabelde neuron synapsen, waardoor gedetailleerde bepaling van de neuronale circuits. Immunocytochemie kan gecombineerd worden met deze methode om neurotransmitters te onderzoeken binnen de gelabelde neuron en de chemische fenotypen van de neuronen waarmee de gelabelde neuronen synapsen te bepalen. De gelabelde neuron kan ook worden verwerkt voor elektronenmicroscopie van de ultrastructurele functies en microcircuits van de gelabelde neuron te bepalen. Algemene deze techniek is een krachtige methode om grondig te karakteriseren neuronen tijdens de in-vivo-beweging waardoor substantieel inzicht in de rol van het neuron in de sensomotorische functie.
1. Dier Voorbereiding
2. Electrode voorbereiding
3. Elektrofysiologische opname en intracellulaire kleuring
4. Tissue verwerking
5. De combinatie van methode met retrograde etikettering, immunocytochemie, confocale imaging, kwantitatieve analyse colocalization
Het succes van het combineren van deze techniek met andere methoden is grotendeels afhankelijk van goed intracellulaire etikettering.
6. Representatieve resultaten:
Een overzicht van de vertegenwoordiger resultaten die kunnen worden verkregen met behulp van deze methode zijn weergegeven in figuur 1. Deze single hersenstam neuron was elektrofysiologische opgenomen tijdens beweging van de onderkaak en zoals duidelijk te zien, de reactie van deze neuron (Figuur 1 linksonder, licht blauw) werd gemoduleerd tijdens beweging. Dit neuron werd geïnjecteerd met biotinamide na elektrofysiologische karakterisatie en vervolgens worden verwerkt voor visualisatie. De gereconstrueerde neuron (Figuur 1 midden, groen) kan echtted om een anatomische mijlpaal, in dit geval de nervus motor kern aangewezen (rode contour). Op basis van de neuronale respons tijdens de beweging en de wederopbouw dit neuron geïdentificeerd kan worden als een secundaire spier spindel afferente neuron. Figuur 2 toont een representatief voorbeeld van de fysiologische respons van een neuron tijdens de kaak verplaatsing. De reactie van het neuron wordt voorgesteld als onmiddellijk afvuren frequentie. Merk op dat de neuronale respons nauwkeurig onderkaak verplaatsing aanduidt dat dit neuron sensorische feedback met betrekking tot mandibulaire standpunt bepaalt nabootst. Figuur 3 is een hoge vergroting beeld van een intracellulair gekleurde axon gecombineerd met een kleuring voor synaptofysine en een Nissl vlek. Let op de colocalization van synaptofysine (geel) in het axon Bouton. Figuur 4 is een animatie van een enkele, fysiologisch gekarakteriseerd en intracellulair gelabeld neuron.

Figuur 1. Overzicht van de methode. Links boven: de onderkaak verplaatsing. Midden Intracellulaire opname (groen) van single neuron (geel). De morfologie van deze neuron werd gereconstrueerd na de intracellulaire opname en injectie. Rode contouren geeft de locatie van de trigeminus motor kern. Linksonder: de fysiologische respons van deze neuron tijdens de kaak beweging.

Figuur 2. Vertegenwoordiger fysiologische reactie van een enkele spier sensorisch neuron opgenomen in vivo tijdens de beweging van de onderkaak. Let op de gelijkenis van de neuronale respons met kaak verplaatsing.

Figuur 3. Terminal axonale arborization met synaptische boutons (rode zwellingen) van een intracellulair gekleurde sensorische neuronen, die reageerde tijdens de spier sonderen. Latere immunocytochemische verwerking voor synaptofysine shows lokalisatie van synaptofysine binnen de axonale Bouton (geel). Green is een fluorescerende vlek Nissl.
Figuur 4. Animatie van de spier spindel primaire afferente neuron axon waarvan de fysiologische respons werd gevonden in vivo tijdens de mandibulaire beweging, was het axon vervolgens intracellulair gekleurd en verwerkt voor visualisatie.
Download hier een hoge resolutie video van figuur 4
Download hier een gemiddelde resolutie video van figuur 4
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De methode hier geïllustreerd is een krachtige techniek die van belang inzicht geeft in de functie van enkelvoudige neuronen en hoe de reactie van individuele neuronen draagt bij aan neuronale circuits. Negen Deze kennis is fundamenteel voor het begrijpen van sensomotorische functie. De grootste kracht van deze techniek is dat het bepalen van een groot aantal parameters over een neuron met fysiologie, morfologie en synaptische morfologie en distributie mogelijk maakt. In combinatie met andere technieken, zo...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Ik dank Anthony Taylor voor de initiële opleiding in in vivo intracellulaire opname en A Brown en David Maxwell voor hulp bij de initiële ontwikkeling van de intracellulaire kleuring techniek. Ik dank M. Zilver voor hulp met de collocalization macro. Veel geleerden met wie ik heb samengewerkt inzicht gegeven in de ontwikkeling van deze techniek waaronder R. Donga, M. Moritani, P. Luo, R. Ambalavanar. Deze techniek werd ontwikkeld met aanzienlijke steun van de NIH subsidie DE10132, DE15386 en RR017971.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Naam van het reagens of apparatuur | Vennootschap | Catalogus nummer | Reacties |
| elektromagnetische vibrator | Ling Dynamic Systems | V101 | |
| signaal generator | Feedback Systems | PFG605 | geschikt voor het produceren trapeziumvormige uitgangssignaal |
| elektrode glas | Sutter Instrumenten | AF100-68-10 | voor gloeilampen en |
| elektrode puller | Sutter Instrumenten | Model P-2000 of P-80 | |
| biotinamide | Vector Laboratories | SP-1120 | bewaard bij 4 ° C |
| Texas Red avidine DCS | Vector Laboratories | A-2016 | |
| tetramethlyrhodamine | Molecular Probes | D-3308 | 3000 moleculair gewicht, lysine Muur |
| muis anti-synaptofysine antilichaam | Chemicon | MAB5258 | |
| fluorescerende Nissl vlek | Neurotrace, Molecular Probes | N-21480 | |
| elektrode tester | Winston Electronics | BL-1000-B | naar elektrode impedantie te meten |
| electrometer | Axon Instruments | Axoprobe 1A, 2B Axoclamp |
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken
Toestemming aanvragen