Fysiologische, morfologische en neurochemische Karakterisering van neuronen gemoduleerd door Movement

Samenvatting

Een techniek wordt beschreven om de in vivo fysiologische reactie van zoogdieren neuronen tijdens beweging kwantificeren en de fysiologie van het neuron met neuronale morfologie, fenotype neurochemische en synaptische microcircuits correleren.

Samenvatting

De rol van individuele neuronen en hun functie in neuronale circuits is fundamenteel voor het begrijpen van de neuronale mechanismen van sensorische en motorische functies. De meeste onderzoeken van sensorimotorische mechanismen beroepen op onderzoek van neuronen, terwijl een dier is statisch ^1,2 of neem extracellulaire neuronale activiteit tijdens een beweging. ^3,4 Hoewel deze studies hebben de fundamentele achtergrond voor sensomotorische functie, ofwel ze geen functionele informatie te evalueren die optreedt tijdens een beweging of zijn beperkt in hun mogelijkheden om volledig te karakteriseren van de anatomie, fysiologie en neurochemische fenotype van het neuron. Een techniek is hier te zien die het mogelijk maakt een uitgebreide karakterisering van de individuele neuronen tijdens een in-vivo-beweging. Deze techniek kan niet alleen gebruikt worden om de primaire afferente neuronen bestuderen, maar ook om motoneuronen en sensomotorische interneuronen te karakteriseren. Aanvankelijk was de reactie van een enkel neuron is geregistreerd met behulp van elektrofysiologische methoden tijdens de verschillende bewegingen van de onderkaak, gevolgd door de bepaling van het receptieve veld voor de neuron. Een neuronale tracer is vervolgens intracellulair geïnjecteerd in de neuron en de hersenen is zo bewerkt dat het neuron kan worden gevisualiseerd met licht, elektronen of confocale microscopie (afb. 1). De gedetailleerde morfologie van het neuron gekenmerkt wordt vervolgens gereconstrueerd, zodat neuronale morfologie kan worden gecorreleerd met de fysiologische reactie van het neuron (afb. 2,3). In deze mededeling belangrijke sleutel details en tips voor een succesvolle implementatie van deze techniek zijn voorzien. Waardevolle aanvullende informatie kan worden bepaald voor de neuron onder studie door het combineren van deze methode met andere technieken. Retrograde neuronale de etikettering kunnen worden gebruikt om de neuronen te bepalen met welke de gelabelde neuron synapsen, waardoor gedetailleerde bepaling van de neuronale circuits. Immunocytochemie kan gecombineerd worden met deze methode om neurotransmitters te onderzoeken binnen de gelabelde neuron en de chemische fenotypen van de neuronen waarmee de gelabelde neuronen synapsen te bepalen. De gelabelde neuron kan ook worden verwerkt voor elektronenmicroscopie van de ultrastructurele functies en microcircuits van de gelabelde neuron te bepalen. Algemene deze techniek is een krachtige methode om grondig te karakteriseren neuronen tijdens de in-vivo-beweging waardoor substantieel inzicht in de rol van het neuron in de sensomotorische functie.

Protocol

1. Dier Voorbereiding

1. Verdoven rat met natriumpentobarbital (50mg/kg IP) en leg ze op een verwarmingselement. Scheren de huid bovenliggende het achterste schedel met dierlijke tondeuse. Controleer het dier om te verzekeren dat een chirurgische niveau van niveau van anesthesie is verkregen door het testen voor het ontbreken van een terugtrekking reflex en vocalisatie bij de tenen worden afgekneld, alsook de afwezigheid van een oogleden reflex. Controleer het niveau van de anesthesie elke 15 minuten en onderhouden van een chirurgische niveau van anesthetisa door injecties met natriumpentobarbital 15mg/kg elke 45 minuten.
2. Gebruik aseptische techniek en maakt een sneetje in de lies regio net distaal van de vouw gevormd door de buik en dijbeen en plaats een canule (1 mm diameter, Clay Adams) in de lies, en femorale slagader. Maak een middellijn incisie in de submandibulaire regio, weerspiegelen de infrahyoid spieren. Maak een kleine incisie in de luchtpijp en plaats een canule (2mm diameter) aan ventilatie mogelijk te maken. Tye een hechting rond de trachael cannual om deze vast in place.Monitor systemische diastolische en systolische bloeddruk via de arteriële canule. In aanvulling op het toezicht op de terugtrekking en palpebrale reflex nu controleren de bloeddruk tot het niveau van de anesthesie te beoordelen. Dien extra verdoving indien nodig via de veneuze canule.
3. Zet de rat in een stereotaxische frame en het uitvoeren van een craniotomie om de kleine hersenen bloot te leggen. Bevestig de tracheale canule om een ​​knaagdier ventilator. Ventileer het dier met een volume van 2 cm ³ met een snelheid van 100/min met bevochtigde lucht. Een positieve-en uitademingsdruk van 1 cm H ₂ O moet worden gehandhaafd om long instorting te voorkomen. Elke 15 minuten hyperinflate de longen naar atelectase te voorkomen. Bedek het oppervlak van de hersenen met warme minerale olie (30 ° C). Wees voorzichtig om de grote veneuze sinus bevindt zich direct onder de kruising van de pariëtale en interparietal botten te voorkomen.
4. Van toepassing cyanoacrylaat lijm aan een stang gekoppeld aan een elektromagnetische vibrator en voeg de staaf in de diastema van de kaak. Beweeg de onderkaak met behulp van commando-signalen naar de vibrator van ofwel een A / D computer-uitgang of een signaal generator.
5. Plaats een siliver-zilverchloride aardelektrode onder de huid naast de craniotomie.

2. Electrode voorbereiding

1. Fabriceren micro-elektroden van kwarts of aluminosilicaatglas met behulp van een horizontale micro-elektrode trekker.
2. Vul de micro-elektrode met 5-10% biotinamide opgelost in 0,25 M KCl en 0,5 M Tris-HCl buffer (pH 7,6) of 2% tetramethlyrhodamine in een zoutoplossing (pH 6). Controleer elektrode impedantie met een elektrode tester. Om op te nemen van grote diameter axons maken elektroden met een impedantie van 60-80M Ω, voor kleine axonen en interneuronen maken elektroden met impedantie van 80-150MΩ.
3. Plaats de micro-elektrode in het hoofd stadium van de electrometer. Visualiseer de elektrode door middel van een kleine telescoop (20X met een gesloten dradenkruis), die wordt vastgesteld in positie achter het hoofd van het dier. Met behulp van de telescoop is belangrijk omdat het laat elektroden stereotaxically worden geplaatst met grote precisie.

3. Elektrofysiologische opname en intracellulaire kleuring

1. Maak een kleine opening in de pia mater en overcompenseren de capaciteit feedback, zodat wanneer de elektrode in de hersenen raakt een feedback signaal wordt geproduceerd. Dit maakt nauwkeurige locatie van het oppervlak van de hersenen.
2. Produceren herhaald mandibulaire verplaatsing en vooraf de elektrode in de hersenen met een stappenmotor.
3. Herken neuronale impalements door de plotselinge daling van de DC-potentieel en identificeren intrasomatic neuronale impalements door continue synaptische activiteit. Zoemend de elektrode met overcompensatie van capaciteit of het tikken zelden produceren een succesvolle cel penetratie. Door de hoge impedantie van de elektroden, zijn neuronale responsen zelden voorafgaand waargenomen penetratie.
4. Nadat je doorboren een neuron en de penetratie wordt geacht stabiel is, kenmerken de neuronale respons met helling en vast te houden en sinusoidale kaak beweging. ⁵ Kaart van de receptieve veld van het neuron door het sonderen van de huid rond de kop en intra mondholte met een niet-geleidende probe zoals een houten stok. Indien relevant voor het onderzoek, onderzoekt de reactie van het neuron naar andere functioneel relevante stimuli zoals spiercontractie en schadelijke stimuli. ^Zes primaire afferente nociceptieve neuronale receptoren reageren op nociceptieve stimuli. Algemene anesthesetics zoals natriumpentobarbital niet axonale geleiding niet blokkeren in het primair afferente neuronen, maar eerder druk synaptische transmissie. Zo axonale geleiding in de primaire afferente neuronen axon is bewaard gebleven.
5. Injecteren stroom (DC, 1-4NA) voor een totaal injectie van 15-70nA minuten. Monitor elektrode penetratie tijdens de huidige injectie en te staken indien membraanpotentiaal wordt meer positieve dan 30mV.

4. Tissue verwerking

1. Euthanaseren het dier door overdosis pentobarbital (140mg/kg IV) en perfuseren met een vasculaire spoelen (0,9% NaCl 38 ° C met 500 eenheden van heparine en 1 ml 2% xylocaine gevolgd door 4% paraformaldehyde in 0,1 M fosfaatbuffer (pH 7,4) .
2. Verwijder de hersenen en het gedeelte dat op 50-100 urn met behulp van een vibratome in een van beide de frontale, sagittale of horizontale vlak. Secions worden verzameld vrij zwevend in de 25 ° C PBS.
3. Proces in de hersenen voor DAB door incuberen in 1-2% normaal serum geit en 1% Triton X-100 in 0,01 M PBS gevolgd door incubatie in avidine biotine complex (01:50 Elite Vectastain). Reageer secties met behulp van nikkel-DAB met H ₂ O _2. Te verwerken voor Texas Red, incuberen secties in avidine-biotine complex (01:50) in PBS overnacht bij 4 ° C en vervolgens incubeer bij 4% Texas Red avidine DCS in PBST bij 4 ° C gedurende de nacht. Achtergrondkleuring secties met een fluorescerende Nissl vlek (NeuroTrace) 20min bij 23 ° C.
4. Als neuron was geïnjecteerd met rhodamine, direct visualiseren de ingespoten neuron met een fluorescentiemicroscoop (Ex 545nm).

5. De combinatie van methode met retrograde etikettering, immunocytochemie, confocale imaging, kwantitatieve analyse colocalization

Het succes van het combineren van deze techniek met andere methoden is grotendeels afhankelijk van goed intracellulaire etikettering.

1. De methode gevisualiseerde hier kan eenvoudig worden gecombineerd met retrograde neuronale etikettering. ^7-10 Om dit te doen verdoven van de dieren en het gebruik van aseptische technieken, injecteren een neuronale tracer, zoals mierikswortelperoxidase (20% mierikswortelperoxidase. Sigma VI, Sigma) en 1% tarwekiemen aggultinated mierikswortelperoxidase (Sigma) in de perifere regio's richten, zoals de kauwspieren. Deze neuronale tracer zal worden opgenomen in perifere axonen en vervoerd via axonaal transport naar de motoneuron somata. Voor de kauwspieren, is 15μl van de tracer geïnjecteerd in de spier met behulp van een steriele 10 microliter injectiespuit. Dieren worden vervolgens geplaatst op een verwarmings-pad en gecontroleerd totdat hersteld van anesthesie en vervolgens in hun kooien voor herstel. Na 24 uur, verdoven dieren en fysiologisch karakteriseren neuronen en intracellulair vlek hen. Dan perfuseren het dier, zoals hierboven en proces weefselcoupes beschreven voor de aanwezigheid van HRP met tetramethylbenzidine (TMB) als de chromagen en natriumwolframaat als de stabilisator en geïntensiveerd met kobalt. Secties in plaats van 1% natriumwolframaat opgelost in 0,1 M PBS (pH 6,5) en 0,0007% TMB opgelost in absolute ethanol en aceton bij 15 ° C gedurende 20 minuten. Dan reageren weefselcoupes door het toevoegen van 1,0 ml van 0,3% H ₂ O ₂ per 100 ml van incubatie-oplossing voor 60 minuten. Spoel weefsel in 0,1 M PBS (pH 6,5) en de plaats in 0,05% diaminobenzidine (pH 7,4), 0,02% kobalt, en 0,01% H ₂ O ₂ in 0,1 M PBS (pH 7,4) gedurende 10 minuten. bij 37 ° C. Proces het weefsel voor de visualisatie van het neuron geïnjecteerd met biotinamide zoals beschreven en visualiseren de relaties tussen de gelabelde sensorische neuron en een verscheidenheid van motoneuronen.
2. De techniek hier getoond wordt kan ook gemakkelijk worden gecombineerd met immnocytochemistry. ⁶ Als een voorbeeld, immunocytochemically de hersenen voor synaptofysine proces nauwkeurig te lokaliseren synapsen binnen gelabeld neuronen (afb. 3). Om dit te doen, incubeer hersenen secties in muis anti-synaptofysine antilichaam (1:10.000) voor 2 dagen bij 4 ° C en vervolgens in anti-muis FITC (1:400) incubeer gedurende 1 uur bij 23 ° C.
3. Neuronen gemerkt met fluorescerende merkers of verwerkt voor fluorescerende beeldvorming zijn ideaal voor confocale beeldvorming. Figuur 3 is een voorbeeld van een optische gedeelte verkregen met confocale microscopie door middel van een axon Bouton. (Afb. 3). Genereer animaties van gelabelde neuronen door het verwerven van meerdere optische secties door het label neuron (afb. 4).
4. Neuronen gelabeld met deze methode kan worden gebruikt voor kwantitatieve colocalization analyse. Om dit te doen, gebruik maken van een voor iedereen beschikbare software macro in combinatie met NIH Image (te vinden op http://phy.ucsf.edu/ ° IDL / colocalization.htm). Lokaliseren synaptofysine binnen enkele axon terminals door het combineren van intracellulaire etikettering met synaptofysine immunocytochemie. ⁶

6. Representatieve resultaten:

Een overzicht van de vertegenwoordiger resultaten die kunnen worden verkregen met behulp van deze methode zijn weergegeven in figuur 1. Deze single hersenstam neuron was elektrofysiologische opgenomen tijdens beweging van de onderkaak en zoals duidelijk te zien, de reactie van deze neuron (Figuur 1 linksonder, licht blauw) werd gemoduleerd tijdens beweging. Dit neuron werd geïnjecteerd met biotinamide na elektrofysiologische karakterisatie en vervolgens worden verwerkt voor visualisatie. De gereconstrueerde neuron (Figuur 1 midden, groen) kan echtted om een ​​anatomische mijlpaal, in dit geval de nervus motor kern aangewezen (rode contour). Op basis van de neuronale respons tijdens de beweging en de wederopbouw dit neuron geïdentificeerd kan worden als een secundaire spier spindel afferente neuron. Figuur 2 toont een representatief voorbeeld van de fysiologische respons van een neuron tijdens de kaak verplaatsing. De reactie van het neuron wordt voorgesteld als onmiddellijk afvuren frequentie. Merk op dat de neuronale respons nauwkeurig onderkaak verplaatsing aanduidt dat dit neuron sensorische feedback met betrekking tot mandibulaire standpunt bepaalt nabootst. Figuur 3 is een hoge vergroting beeld van een intracellulair gekleurde axon gecombineerd met een kleuring voor synaptofysine en een Nissl vlek. Let op de colocalization van synaptofysine (geel) in het axon Bouton. Figuur 4 is een animatie van een enkele, fysiologisch gekarakteriseerd en intracellulair gelabeld neuron.

Figuur 1. Overzicht van de methode. Links boven: de onderkaak verplaatsing. Midden Intracellulaire opname (groen) van single neuron (geel). De morfologie van deze neuron werd gereconstrueerd na de intracellulaire opname en injectie. Rode contouren geeft de locatie van de trigeminus motor kern. Linksonder: de fysiologische respons van deze neuron tijdens de kaak beweging.

Figuur 2. Vertegenwoordiger fysiologische reactie van een enkele spier sensorisch neuron opgenomen in vivo tijdens de beweging van de onderkaak. Let op de gelijkenis van de neuronale respons met kaak verplaatsing.

Figuur 3. Terminal axonale arborization met synaptische boutons (rode zwellingen) van een intracellulair gekleurde sensorische neuronen, die reageerde tijdens de spier sonderen. Latere immunocytochemische verwerking voor synaptofysine shows lokalisatie van synaptofysine binnen de axonale Bouton (geel). Green is een fluorescerende vlek Nissl.

Figuur 4. Animatie van de spier spindel primaire afferente neuron axon waarvan de fysiologische respons werd gevonden in vivo tijdens de mandibulaire beweging, was het axon vervolgens intracellulair gekleurd en verwerkt voor visualisatie.
Download hier een hoge resolutie video van figuur 4
Download hier een gemiddelde resolutie video van figuur 4

Discussie

De methode hier geïllustreerd is een krachtige techniek die van belang inzicht geeft in de functie van enkelvoudige neuronen en hoe de reactie van individuele neuronen draagt ​​bij aan neuronale circuits. ^Negen Deze kennis is fundamenteel voor het begrijpen van sensomotorische functie. De grootste kracht van deze techniek is dat het bepalen van een groot aantal parameters over een neuron met fysiologie, morfologie en synaptische morfologie en distributie mogelijk maakt. In combinatie met andere technieken, zo...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van het reagens of apparatuur	Vennootschap	Catalogus nummer	Reacties
elektromagnetische vibrator	Ling Dynamic Systems	V101
signaal generator	Feedback Systems	PFG605	geschikt voor het produceren trapeziumvormige uitgangssignaal
elektrode glas	Sutter Instrumenten	AF100-68-10	voor gloeilampen en
elektrode puller	Sutter Instrumenten	Model P-2000 of P-80
biotinamide	Vector Laboratories	SP-1120	bewaard bij 4 ° C
Texas Red avidine DCS	Vector Laboratories	A-2016
tetramethlyrhodamine	Molecular Probes	D-3308	3000 moleculair gewicht, lysine Muur
muis anti-synaptofysine antilichaam	Chemicon	MAB5258
fluorescerende Nissl vlek	Neurotrace, Molecular Probes	N-21480
elektrode tester	Winston Electronics	BL-1000-B	naar elektrode impedantie te meten
electrometer	Axon Instruments	Axoprobe 1A, 2B Axoclamp