Immunocytochemie is een krachtige methode om de aanwezigheid, subcellulaire lokalisatie, en relatieve rijkdom van een antigeen van belang in gekweekte cellen te bepalen. Dit protocol biedt een makkelijk te volgen serie van stappen die in staat zal stellen een om antistoffen te behouden en het meeste uit je vlekken krijgen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Immunocytochemie: menselijke neurale stamcellen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Immunocytochemie is een zeer krachtige en vrij eenvoudige methode voor het bepalen van de aanwezigheid, subcellulaire lokalisatie, en relatieve rijkdom van een antigeen van belang, meestal een eiwit, in gekweekte cellen. Dit protocol biedt een makkelijk te volgen reeks van stappen die in staat zal stellen onderzoekers aan primaire en secundaire antilichamen te besparen, terwijl het krijgen van hoge kwaliteit, reproduceerbare kwalitatieve en kwantitatieve gegevens uit hun vlekken. Er zijn twee aspecten van dit protocol die helpen om het volume van antilichaam nodig voor kleuring behouden. Voor een, zijn de cellen gekweekt op kleine, ronde dekglaasjes die zijn geplaatst in putjes van een weefselkweek plaat. Na fixatie, kunnen de cellen op de dekglaasjes verwijderd worden uit de putjes van de plaat. Voor antilichaam kleuring, is het dekglaasje met cellen omgekeerd op een kleine daling van antilichamen oplossing op parafilm en is bedekt met een tweede stuk van Parafilm om uitdroging te voorkomen. Met behulp van deze methode is slechts ~ 25 ui van antilichaam-oplossing die nodig is voor elke dekglaasje (of monster), te worden gemerkt. Dit protocol beschrijft immunokleuring van menselijke neurale stamcellen / precursor cellen (hNSPCs), maar kan worden gebruikt voor vele andere celtypes.
Protocol
Dag 1: Voorbereiding van de Duitse dekglaasjes en zaaien Cellen
Let op: Duitse dekglaasjes worden vaak voorkeur voor het kweken van primaire neurale stamcellen en neuronen. We gebruiken de volgende schoonmaak protocol om celadhesie en de verspreiding te verbeteren. Positie coverslips in een klein rek dat vloeibare toegang tot beide zijden van het dekglaasje zal toestaan. De eerste, incubeer dekglaasjes in 1% Liquinox gedurende 10 minuten, gevolgd door drie wasbeurten met gedemineraliseerd water. Zorg dat er geen zeepbellen blijven. Vervolgens glijdt incuberen in 1 M HCl gedurende 30 minuten, gevolgd door drie wasbeurten met gedemin....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit protocol beschrijft een procedure voor immunokleuring hNSPCs dat het volume van antilichamen nodig minimaliseert en geeft betrouwbare cel vlekken. De procedure zoals beschreven is het beste voor intracellulaire antigenen, maar kan worden aangepast aan het celoppervlak moleculen vlek of vlekken van het cytoskelet te verbeteren.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Dankbetuigingen
De auteurs willen dr. Philip H. Schwartz van de National Human Resource Neural Stamcel erkennen bij de Children's Hospital, Orange County Instituut voor het verstrekken van hNSPC culturen en dr. Gary Bassell aan de Emory University voor een eerste instructie in de parafilm vlekken techniek.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen | |
|---|---|---|---|---|
| Duitse glas (Deutsche Spiegelglas) dekglasjes | Instrument | Carolina Biological | WW-63-3029 | dekglasjes van 12,15,18, 22, 25 mm beschikbaar |
| Liquinox fosfaatvrij detergent | Reagens | Sigma-Aldrich | Z273279 | zeer viskeus |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Reagens | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| Laminine, natuurlijk muis | Reagens | Invitrogen | 23017-015 | |
| EMEM (1X) | Reagens | Mediatech, Inc. | MT-10-010-CV | Gedistribueerd door Fisher onder het aangegeven catalogusnummer |
| 24-well plaat | Instrument | Fisher Scientific | 08-772-1 | |
| Triton X-100 | Reagens | Fisher Scientific | BP151-500 | zeer viskeus |
| Paraformaldehyde | Reagens | Sigma-Aldrich | P6148 | potentieel carcinogeen, wees voorzichtig bij gebruik in poeder- en oplossingsvorm |
| Bovien Serum Albumine, IgG-vrij | Reagens | Jackson ImmunoResearch | 001-000-161 | |
| H–chst 33342 | Reagens | Invitrogen | H-1399 | |
| Vectashield | Reagens | Vector Laboratories | H-1000 | viskeus |
Referenties
- Flanagan, L. A., Chou, J., Falet, H., Neujahr, R., Hartwig, J. H., Stossel, T. P., Filamin, A. Filamin A, the Arp2/3 complex, and the morphology and function of cortical actin filaments in human melanoma cells. J. Cell Biol. 155, 511-518 (2001).
- Flanagan, L. A., Rebaza, L. M., Derzic, S., Schwartz, P. H., Monuki, E. S.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
