$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Nicotiana benthamiana planten worden gekweekt in een temperatuur-gecontroleerde groei kamer bij 25 ° C. Volledig uitgebreid gezonde bladeren van 3-6 week oude planten worden gebruikt.
Tip: Betere resultaten worden verkregen met behulp van nieuw opkomende bladeren
1. Agrobacterium voorbijgaande infiltratie protocol:
Dag 1
- Streak LB / Rifampicine (25 ug / ml) / kanamycine (100 ug / ml) agarplaten met glycerol voorraden van Agrobacterium tumefaciens (stam LBA4404) met de geschikte vectoren met het gen (s) te worden getest op celdood en de vector met GUS de cassette onder een constitutieve promotor. Altijd een lege vector controle als een negatieve controle.
- Incubeer bij 28 ° C gedurende 2 dagen.
Dag 3
- Inoculeren 2 ml LB met Rifampicine (25 ug / ml) en kanamycine (100 ug / ml) met een enkele kolonie van elkaar LB / Rifampicine / Kanamycine plaat eerder strepen.
- Incubeer elke cultuur door schudden bij 28 ° C voor 24 uur bij 200 rpm tot maximale groei dichtheid is bereikt.
Tip: Klontvormende wordt soms waargenomen, in welk geval culturen moeten grondig worden geresuspendeerd (dat wil zeggen en neer te pipetteren) voordat u verder gaat.
Dag 4
- Na de incubatie, streeft het totale volume tot 10 ml met verse LB (met de juiste antibiotica) en acetosyringone (eindconcentratie 25 uM).
- Incubeer elke cultuur door schudden bij 28 ° C voor een ander 16 uur.
Dag 5
- De volgende dag twee keer te wassen elke cultuur door het toevoegen van 10 ml (niet toe te voegen acetosyringone) infiltratie medium (10 mM MgSO 4 0.7 H 2 O, 9 mM MES, pH 5.6) en gecentrifugeerd bij 4000 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
- Na de laatste centrifuge stap, opnieuw in suspensie elke cultuur in 5 ml infiltratie medium dat acetosyringone (100 uM).
- Meet de OD 600 nm, metingen tussen 0,1 en 0,9 aanvaardbaar zijn.
Tip: OD 600 nm van zo laag als 0.1 zijn gebruikt zonder een probleem is echter, kunnen hogere ODS produceren meer consistente resultaten. - Incubeer de drie culturen voor meer uur naar de Agrobacterium culturen voor infectie te bereiden.
- Meng culturen die het gen (s) te worden geanalyseerd en de negatieve controle (Agrobacterium met de lege vector) in een 1:1 verhouding met de cultuur die het GUS cassette.
- Infiltreren in de abaxiale (onder) kant van nieuw opkomende bladeren met behulp van een 1 ml naald-less spuit (afb. 1).
Tip: Infiltreer zowel de negatieve controle mengsel (lege vector + GUS cassette) en het mengsel dat het gen te worden getest (gen x + GUS cassette) aan de tegenoverliggende bladeren van dezelfde plant. Gebruik drievoud planten voor elke behandeling. - 3 dagen na de infiltratie accijnzen bladeren en test geïnfiltreerd voor GUS eiwit expressie.
2. Histochemische GUS-test
Dag 8
- Vacuüm infiltreren van de X-Gluc substraat medium in het weggesneden bladeren.
- Incubeer in het donker bij kamertemperatuur 's nachts, of totdat duidelijk blauwe vlekken verschijnt.
Dag 9
- Spoel in gedestilleerd water.
- Incubeer in 70% ethanol tot chlorofyl wordt verwijderd, dan weer over te dragen aan gedestilleerd water. Visueel beoordelen GUS expressie niveaus.
3. Fluorometrische MUG-test:
Dag 8
- Isoleer totaal eiwit door het malen geïnfiltreerd bladschijfjes in een vijzel met behulp van vloeibare stikstof. Voeg 100 uL van GUS extractiebuffer (50 mM Napi pH 7,0, 10 mM EDTA, 0,1% Triton X-100, 0,1% N-lauroylsarcosine natriumzout, β-mercapto-ethanol (0,7 ul / ml), terwijl het monster op het ijs.
- Centrifugeer suspensie bij 14.000 g gedurende 5 minuten bij 4 ° C en neem supernatant als totaal oplosbaar eiwit.
- Meet de concentratie door middel van een nanodrop volgens de instructies van de fabrikant.
- Stel de eiwitconcentratie tot 100 pg totaal oplosbaar eiwit voor elk monster met behulp van GUS extractiebuffer.
- Voeg MUG substraat (4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide trihydraat) bereid in GUS extractiebuffer tot een uiteindelijke concentratie van 2 mm. Een totaal volume van 100 ul per monster (eiwit + MUG-substraat) moet voldoende zijn.
- Incubeer de reacties gedurende 1 uur bij 37 ° C.
- Stop reacties door het toevoegen van 800 pi van GUS stop buffer (0,2 M Na 2 CO 3).
- Meten fluorescentie behulp van een plaat lezer op een golflengte van 365 nm en emissie golflengte van 455 nm en vergelijk waarden om een MU standaard curve. Rapport niveaus van GUS activiteit als nmol MU / ug totaal oplosbaar eiwit / min.
4. Voorraden en oplossingen:
- Acetosyringone (1 M) voorraad (FW = 196,2 g) - 0,981 g in 5 ml DMSO
- Kanamycine (100 mg / ml) voorraad - voor te bereiden in dH 2 0 - filter steriliseren
- Rifampicine (25 mg / ml) voorraad - voor te bereiden in DMSO
- Luria-Bertani (LB) vloeibare groei media: (1L)
1% (w / v) Bacto-trypton, 10 g
0,5% (w / v) Bacto-gistextract, 5 g
170 mM natriumchloride 10 g
pH - 7 - Acetosyringone (25 uM) = 25 ui van een 1 M voorraad in een eindvolume van 1 ml
- Infiltratie Medium: (1L)
10 mM MgSO 4 0,7 dH 2 0 (FW = 246,48 g), 2,4648 g
9 mM MES (FW = 213,25 g), 1,91925 g
pH - 5,6 - Acetosyringone (100 uM) = 100 ul van een 1 M voorraad in een eindvolume van 1 ml
- GUS extractiebuffer
50 mM Napi pH 7,0, 10 mM EDTA, 0,1% Triton X-100, 0,1% N-lauroylsarcosine natriumzout, β-mercapto-ethanol (0,7 ul / ml) - 2x Fosfaat buffer
0,2 M NaH 2 PO 4 en 0,2 M Na 2 HPO 4 pH 7 - X-Gluc substraatoplossing
Los 1 mg van 5-broom-4-chloor-3-indolyl bd-glucuronide (X-Gluc) in 0,1 ml methanol. Voeg 1 ml 2x fosfaatbuffer, 20 ui 0,1 M kaliumferricyanide, 10μl Triton X-100 10% en 850 ul van gedestilleerd water.
5. Representatieve resultaten:
Naar aanleiding van dit protocol, is het verlies van GUS-expressie verwacht bij celdood optreedt. We hebben tegelijkertijd uitgesproken het reporter-gen, β-glucuronidase (GUS), met een lid van de cyto-beschermende Arabidopsis Bcl-2 Associated athanoGene (BAG) familie. We co-geïnfiltreerd N. benthamiana bladeren met een 35S gedreven BAG expressiecassette en de GUS vector pCAMBIA 2301 met behulp van Agrobacterium-stam LBA4404. Zoals weergegeven in figuur 2, is een zichtbare toename van de GUS-kleuring waargenomen na deze infiltratie. Omgekeerd, wanneer de bekende pro-apoptotische lid van de Bcl-2 familie BAX werd gebruikt, was een duidelijke vermindering van de GUS-kleuring waargenomen (afb. 2). In beide gevallen, GUS expressie was zichtbaar anders vergeleken met de controlegroep. Echter, wanneer het verschil in uitdrukking is minder evident, kan fluorometrische MUG testen worden uitgevoerd om GUS expressie quanitate.
Figuur 1. Voorbeeld van een Agrobacterium mengsel infiltratie van de abaxiale kant van N. benthamiana laat met behulp van een naald 1 ml-spuit minder.
Figuur 2. Een GUS vector werd co-uitgedrukt in N. benthamiana bladeren met de anti-dood-gen, en een bekende inductor van celdood. GUS niveaus werden vergeleken met een lege vector control (GUS controle).