Elastomeer PGS Steigers in Arterial Tissue Engineering

Samenvatting

Elastomeer PGS steigers met vasculaire gladde spiercellen gekweekt in een pulsatiele flow bioreactor kan leiden tot veelbelovende kleine diameter arteriële constructen met inheemse ECM productie in een relatief korte periode van cultuur.

Samenvatting

Hart-en vaatziekten is een van de belangrijkste oorzaak van sterfte in de Verenigde Staten en in het bijzonder, coronaire hartziekte stijgt met de vergrijzing van de bevolking en toenemende zwaarlijvigheid ^1. Op dit moment, bypass-operatie met behulp van autoloog schepen, allografts, en synthetische enten staan ​​bekend als een vaak gebruikt voor arteriële vervangers ^2. Echter, deze enten hebben een beperkte toepassingen wanneer een inwendige diameter van de slagaders is minder dan 6 mm, door de lage beschikbaarheid, trombotische complicaties, compliance mismatch, en laat intima hyperplasie ^3,4. Om deze beperkingen, is tissue engineering met succes toegepast als een veelbelovend alternatief voor de kleine diameter arteriële constructies die zijn nonthrombogenic, robuust, en compliant te ontwikkelen. Verschillende eerdere studies hebben een kleine diameter arteriële constructen met tri-lamellaire structuur, uitstekende mechanische eigenschappen en de barstdruk die vergelijkbaar zijn met inheemse slagaders ^5,6. Terwijl de hoge treksterkte en barstdruk door het verhogen van de productie van collageen uit een stijf materiaal of cel blad steiger, deze constructies nog weinig elastine productie-en compliance, dat is een groot probleem te enten storing veroorzaken na implantatie. Rekening houdend met deze zaken, hebben we de hypothese dat een elastometric biomateriaal gecombineerd met een mechanische conditioning zou elasticiteit en het gedrag van mechanische signalen meer efficiënt vasculaire cellen, die extracellulaire matrix productie te verhogen en te ondersteunen cellulaire oriëntatie.

Het doel van dit rapport is de invoering van een fabricage techniek van poreuze buis steigers en een dynamisch mechanisch conditioneren voor de toe te passen op arteriële tissue engineering. We gebruikten een biologisch afbreekbare elastomeer, poly (glycerol sebacaat) (PGS) ⁷ voor het vervaardigen van poreuze buisvormige steigers van het zout fusion-methode. Volwassen primaire baviaan gladde spiercellen (SMC) werden geënt op het lumen van de steigers, die in onze ontworpen pulsatiele flow bioreactor gekweekt voor 3 weken. PGS steigers had constante dikte en willekeurig verdeeld macro-en micro-poriën. Mechanische conditioning van pulsatiele flow bioreactor ondersteund SMC oriëntatie en verbeterde ECM productie in de steigers. Deze resultaten suggereren dat elastomeer steigers en mechanische conditionering van bioreactor cultuur kan een veelbelovende methode voor arteriële tissue engineering worden.

Protocol

1. Tubular Steiger Fabrication

1. Bereid glazen buis (lengte = 70 mm, buitendiameter = 9,0 mm, wanddikte = 1,0 mm; kleine onderdelen, Miramar, FL) als een mal voor steiger.
2. Bereid 1,0 gew / vol% hyaluronzuur (HA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) door het oplossen van 100 mg van de HA in 10 ml gedeïoniseerd water. Meng met behulp van een rotator 's nachts tot er geen luchtbellen in de oplossing.
3. Giet 1,0% HA-oplossing in de bovenkant van de glazen buizen. Laat het langzaam naar beneden stromen langs de binnenwand van de mal. Flip over de slang bij de bereikte oplossing de onderkant van de mal met behulp van de rotator en herhaal deze stap totdat de binnenwand van de matrijs wordt gelijkmatig bedekt door de oplossing.
4. Na het coaten, droog alle glazen buizen in het vacuüm oven op 37 ° C gedurende 24 uur
5. Grind en zeef zout deeltjes (grootte = 25-32 micrometer) gebruikt als porogens.
6. Monteer een glazen buis (gecoat met 1,0% HA-oplossing binnen), doorn (roestvrij staal omhuld door PTFE slangen), warmtekrimpbare (HS) mouw, en de PTFE-ring zoals eerder is beschreven ^8.
7. Voeg zout deeltjes van de gewenste grootte op het glas mal met behulp van een spatel door het silicium rubber trechter. Tik zachtjes tegen de vorm om een ​​gelijkmatige verdeling van zout deeltjes te verzekeren. Schraap het overtollige zout deeltjes aan de bovenkant van de mal met behulp van de kant van de spatel.
8. Zet de hybridisatie incubator voor 30 minuten voor de overdracht van de zout-packed mal. Schakel de hybridisatie incubator en Doe de zout-verpakt schimmel in de hybridisatie incubator voor zout fusie.
9. Haal de mallen van de hybridisatie incubator en droog ze in het vacuüm oven op 37 ° C gedurende 24 uur
10. Verwijder het zout-packed mallen van het vacuüm oven en laat ze afkoelen op kamertemperatuur. Verwijder de roestvrij stalen doorn door op het naar beneden met het houden van de PTFE-ring. Als de doorn is te strak om de mal, gebruik de naald tang om het eruit te trekken. Verwijder de PTFE-ring van de bodem van de mal.
11. Zet de vormpjes in de oven op 120 ° C gedurende 5 minuten tot HS sleeve krimpen. Controleer of de GS-huls is gekrompen. Verwijder de HS mouw van het zout-packed mallen en laat ze afkoelen op kamertemperatuur. Houd de mallen in de exsiccator totdat ze worden gebruikt.
12. Bereid de PGS-oplossing door het oplossen van 3 g van PGS in 15 ml tetrahydrofuran (THF) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) om een ​​20 gew / vol% oplossing te vormen.
13. Voeg de PGS oplossing voor het lumen van zout-verpakt mallen door te laten vallen met behulp van een spoid in de Hume kap. Lean de glazen mal ongeveer 45 ° en laat de PGS-oplossing in de binnenste lumen met het draaien van de mal langzaam. Controleer of de PGS oplossing stroomt naar beneden langs de muur van schimmel. Als droge plek wordt waargenomen, voeg meer oplossing.
14. Na het toevoegen van de PGS-oplossing, plaats de mallen in de Hume kap voor minstens 30 minuten voor het verdampen THF.
15. Zet de vormpjes in het vacuüm oven voor vooraf vastgestelde uithardingstijd (bijv. 24 / 36 / 48 h) bij 100 mTorr en 150 ° C voor het genezen van PGS.
16. Na uitharding, neem de vormen en leg ze op kamertemperatuur afkoelen. Dip elke vorm in de gedeïoniseerd water met een verticale positie langzaam. Niet dompel ze in het water snel omdat luchtbellen kunnen veroorzaken scheuren het schavot.
17. Breng de mallen voor het waterbad voorzichtig en plaats ze in een hoek gedurende 1 uur gebruik van siliconen tube om gemakkelijk op te lossen HA. Controleer of de HA is opgelost uit de vorm. Als er geen HA is vrijgelaten uit de mal, duw de ene kant van de steiger langzaam met behulp van spatel om deze los uit de mal. Herhaal deze stap aan de andere kant van de steiger en schud de mal heen en weer langzaam in het water bad. Controleer of de steiger wordt verplaatst in de mal.
18. Breng de steiger naar de andere waterbad met roerder zorgvuldig. Grijp niet de steiger vast, die kan barsten het schavot. Plaats de steiger in het waterbad gedurende minstens drie dagen met het veranderen van water om uitlogen zout deeltjes.
19. Na de uitloging zout deeltjes, breng elke steiger aan de 15 ml centrifugebuis gevuld met het gedeïoniseerd water en plaats ze in de droge-ijs box voor een uur te bevriezen. Doe centrifuge buizen in de vriesdroger (alle buizen cabines moeten worden geopend) en lyophilize ze voor 2 dagen.
20. Zet alle steigers in de exsiccator voordat totdat ze worden gebruikt.

2. Steiger Voorbereiding voor mobiele zaaien

1. Haal steigers uit de exsiccator en snijd ze als 25-30mm van lengte.
2. Bereid twee silicone rubber stop (diameter = 20 mm, wanddikte = 6,35 mm, middelste gat diameter = 3 mm) en sluit twee PTFE slangen (buitendiameter = 3,97 mm, inwendige diameter = 2,38 mm, wanddikte = 0,79 mm, lengte = 60 mm en 40 mm) door het midden gaten van iedere stopper.
3. Snijd een HS ring als een 1,5 mm van de lengte en zet het op de top van het ene uiteinde van de steiger. Druk op een PTFE-buis (verbonden silicone rubber stop) in het ene uiteinde van de steiger zo klein overlappende gedeelte mogelijk te maken.
4. Zet het schavot en PTFE slang in de oven op 120 ° C gedurende 10 min tot HS ring krimpen. Controleer of de HS-ring is gekrompen en de steigers zijn verbonden met PTFE slang stevig vast.
5. Haal het schavot en de PTFE-buis en plaats ze op kamertemperatuur afkoelen. Zet het schavot-PTFE slangen assemblage in de polycarbonaat buis (buitendiameter = 15,5 mm, inwendige diameter = 9 mm, lengte = 50 mm) als een bioreactor kamer.
6. Sluit een ander einde van de PTFE-slang aan op de steiger als de stappen 2.3) en 2.4).
7. Pas twee silicone rubber stoppen om hun inwendige oppervlakken hechten aan beide uiteinden van de polycarbonaat buis. Bevestig beide buitenkant van siliconen rubber stop met twee aluminium platen (boven-en onderzijde; width = 20 mm, lengte = 70 mm, dikte = 6,35 mm). Plaats twee draadstangen in de zijkant gat van de plaat en bevestig de polycarbonaat buis (inbegrepen de steiger binnen) om platen door het aandraaien van duim moer schroef op de plaat.
8. Meet de seedable lengte van elke steiger (een lengte tussen de twee ringen HS) en bereken binnenste oppervlakte (π x inwendige diameter x seedable lengte) van elke steiger voor cel zaaien.
9. Wikkel een bioreactor kamer unit met aluminium folie en steriliseer het in de autoclaaf bij 120 ° C gedurende 30 minuten. Steriliseren elk onderdeel (medium reservoir, pomp slangen-, gas-wisselaar, manifolds, en de naald ventiel) van de bioreactor in de autoclaaf bij 120 ° C gedurende 30 minuten en monteer ze in de cel cultuur kap.
10. Pre-treat en spoel steigers met een reeks van perfusie (70, 50, en 25% ethanol gedurende 1 uur, fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS; Mediatech, Herndon, VA) gedurende 2 uur, en SMC kweekmedium gedurende 24 uur door gebruik te maken een peristaltische pomp op 1,0 ml / min in de stroom circuit.

3. Cel zaaien en Cultuur

1. Isoleer primaire arteriële gladde spiercellen (SMC) van de halsslagaders van juveniele man bavianen (Papio Anubis) en karakteriseren ze in twee-dimensionale (2D) cultuur voor passage en zaaien zoals eerder beschreven ^9.
2. Uit te breiden met behulp van de SMC MCDB 131 medium (Mediatech, Herndon, VA) met 10% foetaal bovine serum (Lonza, Walkersville, MD), 1% L-glutamine (Mediatech), 50 ug / ml ascorbinezuur (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ), en een antibiotica-antimycotische oplossing (10.000 IE / ml penicilline, 10.000 ug / ml streptomycine, en 25 ug / ml amfotericine B; Mediatech).
3. Los elk bioreactor kamer uit de stroom circuit in de bioreactor. Zaad SMC (passage 4-6) op het schavot met een dichtheid van 2x10 ⁶ cellen / cm ² door het injecteren van suspensie met 5 ml spuit in het lumen van de steigers na het afsnijden van zowel abluminal (inlaat) en luminale (uitlaat) stromen.
4. Zet alle bioreactor kamers in de hybridisatie incubator bij 37 ° C en draai ze op 2 rpm voor 4 uur, zodat de cellen gelijkmatig verspreiden in het schavot.
5. Haal bioreactor kamers van de hybridisatie incubator bevestig ze naar circuit van de bioreactor stroming in de motorkap. Breng alle bioreactor systeem in celkweek incubator.
6. Sluit de pomp leidingen (inwendige diameter = 1,6 mm) aan het kraakbeen van de peristaltische pomp en lading vers kweekmedium in het reservoir. Start de door-muur perfusie (luminale tot abluminal) bij 1,0 ml / min voor 15 min, gevolgd door luminale stroom alleen.
7. Geleidelijk verhogen van het debiet en de druk van 1,0 ml / min (luminale shear stress: 1,1 dynes / cm ²⁾ en 20 mmHg op dag 1 tot 14,2 ml / min (15,3 dynes / cm ²⁾ en 120 mmHg op dag 21, respectievelijk. Wijzig de pomp slang (inwendige diameter = 3,2 mm) op dag 4 en het medium een ​​keer per week.

4. Tissue Oogsten en Monstervoorbereiding voor Analyse

1. Na 21-dagen cultuur, stop de pomp en klem tubings (inlaat en uitlaat) van het medium reservoir. Maak de pomp slang van het kraakbeen van de peristaltische pomp en de overdracht bioreactor systeem in de motorkap.
2. Klem-en uitlaat tubings van elke bioreactor kamer en verwijder deze van de stroom lus. Open de inlaat slang en bereiden een petrischaal bij de uitlaat slang aan op kweekmedium te verzamelen in de polycarbonaat buis. Open langzaam het stopcontact slangen en verwijder het medium uit de kamer.
3. Los abluminal gauge naald en luminale silicone slangen uit de kamer en maak aluminium platen door het vrijgeven van de duim schroeven. Verwijder de polycarbonaat buis en maak de ene kant van het weefsel te construeren uit de PTFE slang.
4. Bereid een petrischaal gevuld met 10 ml PBS en los andere uiteinde van de constructie van de PTFE slang. Doe construct in de PBS en spoel drie keer.
5. Snijd het construct met een scheermesje als 5-mm lengte. Bevriezen bij -80 ° C vriezer voor biochemische assay of overbrengen naar 15 ml centrifugebuis gevuld met 5 ml vers medium voor mechanische testen of snap bevriezen in de Tissue-Tek een optimale snijtemperatuur verbinding (Sakura Finetek Inc, Torrance, CA ) voor histologie / immunofluorescence vlekken.

5. Representatieve resultaten:

De buisvormige PGS steigers werden vervaardigd met behulp van biologisch afbreekbare elastomeer door zout fusie-methode (Fig. 1A). Elke bioreactor kamer voorzien steigers met zowel luminale en abluminal stromen en kan worden losgemaakt als een aparte eenheid van een van de belangrijkste stroom lus (Fig. 1B). Bioreactor systeem is ontworpen voor het kweken van vier steigers voor een door het regelen en bewaken flow en druk (Fig. 1C & D).

Schematische voorstelling van bioreactor cultuur werd getoond in Fig. 2. Na het zaaien SMC, elke kamer bioreactor werd gedraaid bij 37 ° C gedurende 4 uur om uniform te verdelen cellen in het lumen van de steiger. En dan, werd pulsatiele flow van toepassing op steigers tot en met dag 14 met een geleidelijk toenemende debiet (Fig. 2A) en druk (Fig. 2B). Na dag 14, debiet en de druk constant gehouden tot het einde van de cultuur (dag 21).

Oppervlakte morfologie van de PGS schavot werd onderzocht door scanning elektronenmicroscopie (SEM). Scanning electronenmicroscoop bleek dat schavot had consistent wanddiktes (539 ± 18 um) (Fig. 3A) en willekeurig verdeeld macro-en micro-poriën op het luminale oppervlak (Fig. 3B). Morfometrische parameters van de steiger werd gemeten van Microcomputed tomografie (micro-CT) en de beeldvorming analyse. Gemiddelde poriegrootte is 23,3 ± 3,9 micrometer en poriën interconnectiviteit is 99,4 ± 0,62%, wat betekent dat alle poriën volledig met elkaar verbonden zijn in het schavot. Porositeit gemeten door ethanol verplaatsing is 75,6 ± 2,7%.

Cellulaire morfologie van de PGS construct werd onderzocht door SEM (afb. 4). Meerlaagse SMC volledig bedekt de luminale oppervlak en waren ze loodrecht gericht op doorstroming richting. Deze resultaten tonen aan dat mechanische conditionering van pulsatiele flow bioreactor SMC oriëntatie ondersteunt in het schavot.

De aanwezigheid van extracellulaire matrix (ECM) en elastische vezels werden onderzocht door H & E kleuring en elastine autofluorescentie (afb. 5). H & E kleuring toonde aan dat cellen en eiwitten ECM volledig het lumen van de PGS overdekte bouwen. Elastine autofluorescentie toonde ook de omtrek georganiseerd elastische vezels in de luminale oppervlak van het construct. De productie van ECM eiwitten in PGS-constructen werden gemeten vanaf biochemische assays. De onoplosbare elastine en collageen inhoud werd 20,2 ± 9,1 ng / mg van weefsel en 6,3 ± 1,9 ng / mg van het weefsel, respectievelijk.

Figuur 1. Scaffold fabricage en bioreactor systeem. (A) Schematische weergave van tubulaire steiger fabricage. (B) Bioreactor kamer. Steigers werden aangesloten op PTFE-slangen, geplaatst in de polycarbonaat buis, en vastgesteld door siliconen rubber stop en aluminium platen. Elke kamer heeft twee stromen paden: luminale (door silicone) en abluminal (door gauge naald) stromen. (C) Bioreactor-systeem geplaatst in de couveuse. Het omvat medium reservoir, peristaltische pomp module-, gas-wisselaar, druk transducers, twee manifolds (boven en onder), en naaldventiel. (D) Bioreactor-systeem geplaatst buiten de couveuse. Het omvat de druk controleren, flow control unit, data-acquisitie systeem en computer.

Figuur 2. Schematische voorstelling van de bioreactor cultuur. (A) Cultuur protocol. (B) Toegepaste druk profielen op elk tijdstip (dag 1, 4, 7, en 14).

Figuur 3. Surface morfologie van de PGS schavot. (A) Cross-sectie. (B) Lumen.

Figuur 4. Cellular morfologie van de PGS bouwen. (A) Lumen. (B) Cross-sectie van 45 ° snijden. Pijlen in beide cijfers geven de stroomrichting.

Figuur 5. Histologie en elastine autofluorescentie van de PGS bouwen. (A) H & E kleuring. (B) Corresponderende elastine autofluorescentie. L: lumen. Vergroting: 40X. Schaal bar: 50 pm.

Discussie

De fabricage techniek met behulp van een biologisch afbreekbare elastomeer hier beschreven heeft verschillende functies. (1) Wij gebruikten hyaluronzuur (HA) als het insmeren. Omdat HA is oplosbaar in water, was steiger gemakkelijk vrijgelaten uit de glazen vorm na laten weken in water. In dit rapport, gebruikten we 1,0 gew / vol% van de HA-oplossing, omdat een lage concentratie (<0,5 gew / vol%) van de oplossing is niet viskeus en naar beneden stroomt zo snel als we gieten op de top van glazen buizen. De vacht HA-oplossing gelijkmatig, we omgedraaid de glazen buizen als de oplossing vloog de bodem van de buis en herhaalde deze stap. Dit HA coating is een cruciaal belang voor onze fabricage procedure voor het vrijgeven van de definitieve steigers. (2) Wij gebruikten warmtekrimpbare (HS) hoes voor het behoud van zouten in de glazen buizen. Omdat zouten werden dicht op elkaar gepakt in de ruimte tussen de binnenwand van de glazen buizen en de HS mouw, HS sleeve behouden zouten na het verwijderen van doorn en PTFE-ring in de bodem van de buis. We kunnen verwijderen GS mouw gemakkelijk Door de mal in een oven op 120 ° C gedurende 5 min, en dan krijg buisvormige zout templates. (3) Wij gebruikten het zout fusion-methode. Het is bekend dat zout fusie methode kan porie interconnectiviteit en mechanische eigenschappen te verbeteren door het variëren van fusie tijd ^10. Aangezien we vroeger PGS, waren de macro-poriën die door het zout deeltjes tijdens het uitlogen proces, terwijl de micro-poriën waren waarschijnlijk gegenereerd door glycerol damp gevormd tijdens de PGS uitharden zoals we eerder beschreven ^11. Dus deze methode heeft een potentieel om poreuze buisvormige steigers fabriceren met verschillende macro-en micro-structuren door het variëren van zout deeltjes evenals PGS genezen aandoening.

De mechanische conditionering van de bioreactor heeft pulsatiele flow perfusie (maximale gemiddelde flow = 14 ml / min, maximum schuifspanning = 15,3 dyne / cm ^2, frequentie = 0,5 tot 1,7 Hz) en fysiologisch relevante druk met de PGS schavot, wat leidde tot SMC groei en oriëntatie (afb. 4). Deze resultaten zijn in overeenstemming met eerdere studies melden dat cyclische rek bij deze frequentie en shear stress verhoogt SMC proliferatie ^12, en ECM eiwitproductie ^13,14. Naast de SMC de groei en de oriëntatie, PGS bouwen ondersteund ECM eiwitproductie, in het bijzonder de omtrek elastische vezels (Fig. 5) binnen de 3-week cultuur in de bioreactor georganiseerd. Sommige studies met behulp van een elastomeer steiger als een kleine diameter arteriële constructie hebben aangetoond dat mechanische sterkte en de barstdruk die vergelijkbaar zijn met inheemse slagaders ^15, en snelle integratie in de SMC compliant steigers met behulp van centrifugekolf ^16,17, terwijl er geen elastische vezels werden gevonden in deze constructen. Onze resultaten suggereren dat cyclische radiale uitzetting van de bioreactor verbeterde mechanische signaaltransductie meer effectief te SMC in PGS steiger, die waarschijnlijk heeft bijgedragen aan de synthese en organisatie elastine.

Sinds vasculaire SMC waren de enige cellen die ECM eiwitten geproduceerd in onze aanpak, rustige endotheel en verbeteren van mechanische sterkte die nodig zijn om een ​​klinisch succesvolle kleine diameter arteriële constructies te ontwikkelen. We hebben gemeld dat endotheelcellen samen gekweekt met SMC's gegenereerd een confluente monolaag en ondersteund fenotype eiwitexpressie onder onze cultuur en de mechanische conditionering ^9. Daarom, op basis van onze aanpak hier beschreven, wijziging van co-cultuur experiment omstandigheden zou een volgende stap om de functies van de resulterende constructen te verbeteren en het genereren van nonthrombogenic, robuust zijn, en voldoen arteriële bouwen vergelijkbaar met inheemse slagaders.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van het serum	Vennootschap	Catalogus nummer
Hyaluronzuur natriumzout	Sigma-Aldrich	H7630
Tetrahydrofuran	Sigma-Aldrich	401757
MCDB 131	Mediatech	15-100-CV
Foetaal runderserum	Lonza	BW14-502F
L-glutamine	Mediatech	25-005-CV
Ascorbinezuur	Fisher Scientific	A62-500
Antimycotische antibiotica-oplossing	Mediatech	30 tot 004-CI
Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)	Mediatech	21-031-CV
Tissue-Tek een optimale snijtemperatuur verbinding, 4583	Sakura Finetek	25608-930