Wij presenteren een niet-invasieve sampling aanpak voor een efficiënte haarmonsters te verzamelen van ongrijpbare kleine zoogdieren, zoals te zien voor de Amerikaanse pika. Tonen we het nut van deze methode door extractie DNA van bemonsterd haar en versterken van verschillende soorten van moleculaire merkers vaak gebruikt in studies van wilde dieren ecologie en natuurbehoud.
Methodenartikel
Een niet-invasieve Hair samplingtechniek om High Quality DNA verkrijgen van Elusive kleine zoogdieren
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Niet-invasieve genetische steekproef benaderingen worden steeds belangrijker om het wild populaties te bestuderen. Een aantal studies hebben gemeld met behulp van niet-invasieve technieken om steekproeven populatiegenetica en demografie van wilde populaties een te onderzoeken. Deze aanpak heeft bewezen vooral nuttig bij de behandeling van zeldzame of ongrijpbare soort 2. Terwijl een aantal van deze methoden zijn ontwikkeld om te proeven haren, uitwerpselen en ander biologisch materiaal van carnivoren en middelgrote zoogdieren, zijn ze grotendeels gebleven getest in ongrijpbaar kleine zoogdieren. In deze video, presenteren wij een nieuwe, goedkope en niet-invasieve haar snare gericht op een ongrijpbare kleine zoogdieren, de Amerikaanse pika (Ochotona princeps). Beschrijven we de algemene set-up van het haar snare, die bestaat uit stroken van tape gerangschikt in een web-achtige mode en geplaatst langs reizen routes in de Pikas 'habitat. Illustreren we de efficiëntie van de snare op het verzamelen van een grote hoeveelheid haar die vervolgens kan worden opgehaald en teruggebracht naar het lab. Vervolgens hebben we laten zien van het gebruik van de DNA-IQ systeem (Promega) om DNA te isoleren en showcase het nut van deze methode om de meest gebruikte moleculaire merkers met inbegrip van nucleaire microsatellieten, geamplificeerde fragment lengte polymorfismen (AFLPs), mitochondriale sequenties (800bp) en vergroten een moleculaire marker geslachtsbepaling. Over het algemeen tonen we het nut van deze roman niet-invasieve haar strik als een sampling techniek voor wildstand biologen. We verwachten dat deze aanpak zal van toepassing zijn op een verscheidenheid aan kleine zoogdieren, de opening van gebieden van onderzoek binnen natuurlijke populaties, terwijl het minimaliseren van invloed te studeren organismen.
Protocol
1. Haar snare
Voorafgaand aan het opzetten van een snare, een ideale locatie moet worden bepaald binnen de pika habitat of talus helling. Dit geldt ook voor hooi palen, die zijn vegetatie caches dat de dieren te verzamelen in de nazomer evenals verse scats gevonden op latrine sites. Stroken tape (10-50cm in de lengte) worden opgerold om een 360 ° plakkerig oppervlak te verkrijgen en zijn gerangschikt in een web-achtige wijze envelop de ingang van hooi van de pika's paal (fig. 1) of latrine site. Afhankelijk van de configuratie van de rotsen, kan een stuk vislijn worden gebruikt om de structuur van het haar snare te ondersteunen, maar dit is vaak niet nodig als ingangen zijn vrij klein (<30 cm in diameter), een volledige beschrijving van het gebruik van vislijn kan worden gevonden in Henry en Russello (2010) 3. Haar strikken worden zo vaak gecontroleerd als mogelijk, en haar monsters afgezet op de tape (fig. 2) worden vervolgens verzameld en gelabeld. Eenmaal terug naar het lab vervoerd, zijn haren uit het plakband met steriele pincet en overgebracht naar cryogene buizen en opgeslagen bij -20 ° C tot manipulatie. Haarmonsters samen gebundeld worden op een haar strik worden beschouwd als te behoren tot een enkel individu, terwijl de monsters onafhankelijk van elkaar geclusterd worden verondersteld te behoren tot verschillende individuen. In het laatste geval is het haar vervolgens in verschillende buizen. Deze veronderstellingen kunnen later worden getest door middel van DNA-vingerafdrukken en berekeningen van de waarschijnlijkheid van identiteit op basis van microsatelliet genotypische gegevens.
2. DNA-extractie
Omdat pika haar is erg dun en bevat een kleine wortel gloeilamp, hebben we eerder aangetoond dat een minimum van 25 haren nodig zijn om voldoende hoeveelheden DNA te verkrijgen voor een goede kwaliteit downstream PCR-amplificatie 3. We gebruikten het DNA-IQ systeem (Promega, Madison, WI, USA) en een iets aangepaste versie van de instructies van de fabrikant voor DNA-isolatie uit haar monsters. Ten eerste is het haar monster afgedraaid in een micro-centrifuge om het verlies van haar te voorkomen, terwijl het openen van de buis. Dan is de incubatie-oplossing wordt bereid door het mengen van 80 ul van incubatie-oplossing met 10μl van DTT (1M) en 10μl van proteïnase K (18ng/ml) te resulteren in een uiteindelijke concentratie van 0,1 M DTT en 1.8ng/ml van proteïnase K. Incubation oplossing (100 ul) wordt toegevoegd aan het monster en geïncubeerd bij 56 ° C gedurende 1 uur. In de tussentijd is de lysis oplossing bereid door toevoeging van 1 pi van DTT (1M) voor elke 100 ul van lysis buffer, wat resulteert in een uiteindelijke concentratie van 0,01 M DTT. Bereid lysis oplossing (200 ul) wordt vervolgens toegevoegd aan het monster, samen met zeven pi DNA IQ hars, gevortext gedurende 3 seconden op hoge snelheid en geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Het monster wordt vervolgens gevortext 2 seconden en ingevoegd in de magnetische stand, waar de scheiding van magnetische beads uit de oplossing komt. De resterende oplossing wordt vervolgens afgezogen en weggegooid, dat evenwel niet tot de pellet van magnetische hars verstoren. Het monster wordt vervolgens behandeld met 100 ul van de bereide lysis oplossing, gevortext en keerde terug naar de magnetische staan waar scheiding zich opnieuw voordoet. De lysis buffer is opgezogen en verwijderd, en deze stap wordt drie keer herhaald met behulp van een wasbuffer (100 pl). Het monster wordt vervolgens te drogen in de magnetische 15 minuten staan. Eenmaal droog is, wordt 100 ul elutiebuffer toegevoegd aan het monster en geïncubeerd bij 65 ° C gedurende 5 minuten. Het monster wordt gevortexed en ingevoegd in de magnetische stand. De oplossing nu met het geëlueerde DNA wordt vervolgens overgebracht naar een 1,5 ml Eppendorf buis en opgeslagen bij -20 ° C tot verdere manipulaties. DNA van de lever monsters werd ook geëxtraheerd met behulp van de DNA-IQ systeem en gebruikt als een positieve controle voor PCR amplificaties.
3. PCR-amplificatie
De DNA verkregen uit onze niet-invasieve haren snare en lever monsters werden vervolgens gebruikt om een reeks van veel gebruikte moleculaire merkers (microsatelliet, AFLP, mitochondriale cytochroom B en ZFX / ZFY geslachtsbepaling marker) te versterken. PCR's werden uitgevoerd met behulp van een Veriti thermal cycler (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) in een 25 ul volume met: 10 - 20 ng DNA, 0,5 uM van elke primer, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 200 uM dNTPs, 10 μ bovine serum albumine (BSA; New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) en 0,5 U AmpliTaq Gold DNA polymerase (Applied Biosystems). Fietsen parameters voor de microsatelliet loci werden geoptimaliseerd met behulp van een touchdown fietsen programma (10 min bij 95 ° C, 35 cycli bij 95 ° C gedurende 30 s, 30 s gloeien, en 45 s bij 72 ° C, gevolgd door een laatste stap bij 72 ° C gedurende 10 min). De annealing temperatuur daalde met 1 ° C per cyclus 60 tot 55 ° C tot het bereiken van de zesde cyclus, op welk punt de 29 resterende cycli voortgezet bij 55 ° C. Fietsen parameters voor de mitochondriale fragmenten werden zoals hierboven beschreven, maar bestond uit 35 cycli met een gloeientemperatuur van 50 ° C. Amplified Fragment Length Polymorphism werd uitgevoerd volgens het protocol voor de gewervelde genomen beschreven door Bonin 4. Ten slotte werd de moleculaire geslachtsbepaling uitgevoerd met behulp van de PCR-RFLP van ZFX / ZFY loci met HinfI restrictie-enzym digestie 5. De PCR-producten uit de microsatelliet, AFLPs en cytochroom B sequenties werden uitgevoerd op een ABI 3130XL genetische analyzer (Applied Biosystems), terwijl verteerd ZFX / ZFX fragmenten werden uitgevoerd naast een 100 bp ladder (New England Biolabs) op een 3% agarose gel met 2,5% SYBR Safe DNA gel vlek (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) en gevisualiseerd met behulp van een RODE persoonlijke gel imaging-systeem (Alpha Innotech, San Leandro, CA, USA). Microsatelliet en AFLPs werden gevisualiseerd met behulp van Genemapper v3.7 (Applied Biosystems) en het mitochondriale DNA chromatogram werd gevisualiseerd met behulp van Sequencher v4.7 (Gene Code Corporation, Ann Harbour, MI, USA).
4. Representatieve resultaten
Het DNA uit haar monsters verkregen met behulp van onze niet-invasieve snare werden gebruikt om PCR versterken de verschillende type van moleculaire merkers. Als basis voor vergelijking, DNA geëxtraheerd met behulp van de lever monsters werd versterkt samen met ons haar monsters. Nucleaire microsatelliet loci werden met succes versterkt voor zowel haar en lever monsters (afb. 3). Hoewel de intensiteit van het signaal was groter bij gebruik van de lever monsters, heeft dit geen negatief effect op genotype scoren (afb. 3). Vergelijkbare resultaten werden bereikt bij het gebruik van AFLPs (afb. 4), mitochondriale DNA-sequenties (Fig. 5), en de ZFX / ZFY moleculaire marker geslachtsbepaling (Fig. 6).
Figuur 1. Een voorbeeld van een niet-invasieve haar valstrik opgezet op een stapel hooi. Stroken van opgerolde duidelijk verpakkingstape zijn gerangschikt in een web-achtige manier naar de ingang van het hooi stapel omsluiten. Een stuk van de visserij lijn wordt hier gebruikt om extra steun voor het haar snare te bieden.
Figuur 2. Een succesvol haar snare met een groot aantal van haar vast aan de tape te verwijderen.
Figuur 3. Een vertegenwoordiger nucleaire microsatelliet chromatogram (Ocp6) 8 in zoals getoond in Genemapper v3.7 (Applied Biosystems). De top chromatogram werd verkregen door het amplificeren van DNA van leverweefsel, en is heterozygoot (354/358) op dit locus. De onderste chromatogram staat voor een andere persoon vertoont een heterozygoot genotype (358/362) op basis van DNA uit haar. Terwijl het signaal van chromatogram van het haar monster heeft een lagere intensiteit dan de lever monster wordt genotype scoren niet nadelig beïnvloed door dit verschil in signaal.
Figuur 4. Een vertegenwoordiger AFLP chromatogram (E31T32) zoals weergegeven in Genemapper v3.7 (Applied Biosystems). De top chromatogram werd verkregen door het amplificeren van DNA van leverweefsel, de onderste chromatogram staat voor de DNA geëxtraheerd uit haar.
Figuur 5. Een vertegenwoordiger mitochondriaal DNA-sequentie chromatogram (cytochroom B) zoals weergegeven in Sequencher v4.7 (Gene Code Corporation). De top chromatogram werd verkregen door het amplificeren van DNA van leverweefsel, de onderste chromatogram staat voor de DNA geëxtraheerd uit haar.
Figuur 6. Een vertegenwoordiger moleculaire marker geslachtsbepaling (ZFX / ZFY) versterkt voor zowel de lever en haar monsters. Deze aanpak is gebaseerd op de waarneming dat het Y-chromosoom een HinfI restrictieplaats in deze regio dat het X-chromosoom mist bezit. Dus, vrouwen produceren twee co-migratie van fragmenten van 432 bp, terwijl mannetjes produceren van fragmenten van 432 bp, 261 bp en 171 bp.
Discussie
Niet-invasieve genetische sampling is uitgegroeid tot een aantrekkelijk alternatief voor de traditionele leven de vangmethoden om verschillende redenen. Ten eerste door onopvallend te verzamelen biologisch materiaal (bv, uitwerpselen, haren, veren, speeksel en slijm) van wilde populaties, kunnen onderzoekers bestuderen deze soorten zonder storende, behandeling, of zelfs ze te observeren, waardoor de risico's voor zowel de dieren als onderzoekers. Ten tweede, niet-invasieve genetische monsters in staat stelt biologen bestuderen populaties van ongrijpbaar en zeldzame soorten, een taak die kan moeilijk blijken met meer traditionele live-trapping benaderingen 6. En ten derde, kan NGS potentie verhogen steekproeven door het verminderen van verstoring van dieren, bemonstering inspanningen en kosten, hetgeen zal bijdragen tot een minimum te beperken vertekening in de schattingen van de populatie-parameters 7. Dit laatste punt kan van doorslaggevend belang zijn bij de behandeling van bedreigde soorten, omdat bevooroordeelde schattingen van de bevolking van de parameters kan leiden tot onjuist beheer.
In de huidige video-artikel beschrijven we een eenvoudige, nieuwe, goedkope en niet-invasieve methode om ongrijpbare kleine zoogdieren monster, met behulp van de Amerikaanse Pika als een voorbeeld. We laten zien dat DNA geëxtraheerd uit haar presteert vergelijkbaar met DNA uit de lever monsters met betrekking tot de microsatelliet, AFLP, mitochondriale en geslachtsbepaling markers, waardoor deze niet-invasieve methode van monsterneming een aantrekkelijk alternatief voor vangen of dodelijke monsters wonen. Over het algemeen verwachten we dat deze methode nuttig zal zijn bij de gegevensverzameling stadium van de bevolking van genetische en gedragsstudies van zeldzame of ongrijpbare kleine zoogdieren, terwijl het minimaliseren van invloed op de organismen onder studie.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
We willen graag L. Evans, B. Granger, D. Riesling, Z. Sim, A. Goodwin, K. en D. Hayhurst Kuch bedanken voor hulp in het veld. K. Galbreath vriendelijk pika lever monsters die door het Bella Coola vallei. Met dank aan A. Gonçalves da Silva en K. Larsen voor interessante discussies die hebben bijgedragen aan het ontwerp van deze niet-invasieve genetische steekproefmethode. Dit werk werd gefinancierd door de Natural Sciences and Engineering Research Council van Canada Discovery, en UBC Okanagan Individual Research beurzen aan maart Een Zwitserse National Science Foundation Doctoral Fellowship PBSKP3_128523 ondersteund PH. Deze studie werd uitgevoerd naar aanleiding van de dierverzorging protocol van de Universiteit van British Columbia (certificaat nummer: A07-0126).
Materialen
Haar snare:
- Rollen van duidelijke tape (3M, St. Paul, MN, USA)
- Vislijn (10 pond)
- Cryogene buis (2 ml)
- Steriele pincet
- Vloeibare stikstof Dewar (optioneel)
DNA-extractie:
- DNA-IQ systeem (Cat. # DC6701, Promega) met het weefsel en haar extractie kit (Cat. # DC6740, Promega).
- MagneSphere Technology Magnetic Separation Stand (Cat. # Z5342; Promega)
- Micro-centrifuge
- Hybridisatie oven of waterbad
- 1,5 ml Eppendorf buizen
Referenties
- Kendall, K. C. Demography and Genetic Structure of a Recovering Grizzly Bear Population. J Wildlife Manage. 73, 3-3 (2009).
- Rudnick, J. A., Katzner, T. E., Bragin, E. A., DeWoody, J. A. A non-invasive genetic evaluation of population size, natal philopatry, and roosting behavior of non-breeding eastern imperial eagles (Aquila heliaca) in central Asia. Conserv. Genet. 9, 667-667 (2008).
- Henry, P. In situ population structure and ex situ representation of the endangered Amur tiger. Mol Ecol. 18, 3173-3173 (2009).
- Henry, P., Russello, M. A. Obtaining high quality DNA from elusive small mammals using low-tech hair snares. Eur J Wildlife Res. , (2010).
- Bonin, A., Pompanon, F., Taberlet, P. Use of amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers in surveys of vertebrate diversity. Method Enzymol 395. , 145-145 (2005).
- Fontanesi, L. Sexing European rabbits (Oryctolagus cuniculus), European brown hares (Lepus europaeus) and mountain hares (Lepus timidus) with ZFX and ZFY loci. Mol Ecol Resour. 8, 1294-1294 (2008).
- Piggott, M. P., Taylor, A. C. Remote collection of animal DNA and its applications in conservation management and understanding the population biology of rare and cryptic species. Wildl. Res. 30, 1-1 (2003).
- Banks, S. C. Demographic monitoring of an entire species (the northern hairy-nosed wombat, Lasiorhinus krefftii) by genetic analysis of non-invasively collected material. Anim. Conserv. 6, 101-101 (2003).
- Litvaitis, J. A. A range-wide survey to determine the current distribution of New England cottontails. Wildlife Soc B. 34, 1190-1190 (2006).
- Peacock, M. M., Kirchoff, V. S., Merideth, S. J. Identification and characterization of nine polymorphic microsatellite loci in the North American pika, Ochotona princeps. Mol Ecol Notes. 2, 360-360 (2002).
Herprints en machtigingen
