We presenteren een methode voor het chromatine immunoprecipitatie van achterwortelganglia weefsel na axonale schade. De aanpak kan worden gebruikt om specifieke transcriptiefactor bindingsplaatsen en epigenetische modificatie van histon en DNA belangrijk voor de regeneratie van axonen gewonden in zowel het perifere en het centrale zenuwstelsel te identificeren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Chromatine immunoprecipitatie van achterwortelganglia Tissue volgende axonale schade
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Axonen in het centrale zenuwstelsel (CZS) niet regenereren, terwijl die in het perifere zenuwstelsel (PNS) doen regenereren in beperkte mate na een blessure (Teng et al., 2006).. Het is bekend dat transcriptionele programma's essentieel zijn voor neurieten en axonale uitgroei zijn opnieuw op schade in de PNS (Makwana et al., 2005).. Echter, de beschikbare instrumenten neuronale genregulatie in vivo te analyseren zijn beperkt en vaak uitdagend.
De achterwortelganglia (DRG) bieden een uitstekende blessure modelsysteem omdat zowel de centrale en perifere worden gestimuleerd door een gespleten axon afkomstig uit dezelfde soma. De ganglia vormen een discrete verzameling van cellichamen waar alle transcriptionele gebeurtenissen optreden, en dus zorgen voor een duidelijk omschreven gebied van transcriptionele activiteit die gemakkelijk en reproduceerbaar worden verwijderd van het dier. Letsel van zenuwvezels in de PNS (bijv. heupzenuw), waar de axonale regeneratie optreedt, moet onthullen een set van transcriptionele programma's die zich onderscheiden van degenen die reageren op een soortgelijke blessure in het CZS, waar de regeneratie vindt niet plaats (bijv. ruggenmerg ). Sites voor transcriptie factor binding, histon-en DNA-wijzigingen als gevolg van letsel aan een PNS of CZS kan worden gekarakteriseerd met behulp van chromatine immunoprecipitatie (chip).
We beschrijven hier een ChIP protocol met vaste muis DRG weefsel na axonale schade. Deze krachtige combinatie zorgt voor een middel voor het karakteriseren van de pro-regeneratie chromatine-omgeving nodig zijn voor het bevorderen van axonale regeneratie.
Protocol
1. Sciatic & dorsale kolom zenuwletsel
- Het dier wordt geplaatst op een chirurgische handdoek en eronder een thermopad aanwezig is tijdens de gehele procedure houden van de lichaamstemperatuur van de muis bij 37 ° C. Alle dieren zijn verdoofd voor de operatie met een continue isofluraan / O 2 administratie. Chirurgische instrumenten worden geautoclaveerd voordat de procedure.
- Voor sciatic letsel, worden beide achterhand zorgvuldig geschoren, en ontharen wordt aangevuld met generieke haar remover voorafgaand aan de reiniging van de huid met alcohol, gevolgd door Betadyne 3 keer.
- De heupzenuw wordt blootgesteld door het maken van een 4 mm incisie posterior en parallel aan het dijbeen halverwege de dij door de huid en door het verspreiden van de spieren uit elkaar van de biceps femoris met fijne pincet.
- De blootgestelde ischiadicus zenuw is dan gewond, en de huid wordt gesloten met twee hechtdraad clips.
NB: Dezelfde incisie wordt verwezen naar de heupzenuw bloot te leggen, maar de wond is gehecht gesloten waarbij de zenuw intact voor de sham letsel.
- Voor de dorsale kolom letsel, is de achterkant van de muis zorgvuldig geschoren, en het ontharen wordt aangevuld met generieke haar remover voorafgaand aan de reiniging van de huid met alcohol spray / vegen.
- Het ruggenmerg wordt blootgesteld door het maken van een 2,5 cm incisie van ongeveer T7 naar T13. De huid is uit elkaar, en het bindweefsel wordt verwijderd langs de wervel van T9 naar T11.
- Een laminectomie wordt uitgevoerd bij T10 niveau
LET OP: Voor de meeste experimenten, de laminectomie wordt beschouwd als de Sham letsel.
- Een paar druppels Xylocain worden toegevoegd aan het weefsel aan het snoer verdoven, en de dura mater is verwijderd, met aandacht niet naar het ruggenmerg aan te raken.
- De dorsale kolommen zijn gewond en de spier is dicht gehecht, opnieuw aandacht niet naar het ruggenmerg aan te raken. Ten slotte wordt de huid gehecht gesloten met hechtdraad clips. Buprenorfine (0,1 mg / kg lichaamsgewicht) dienen tweemaal daags te worden toegediend gedurende 48 uur of totdat niet meer nodig.
2. Cross-linking
- Ontleden L4 en L5 DRG van de gewonde muizen na euthanization. Verzamel een totaal van 16 DRG in ijskoude HBSS + proteaseremmers cocktail (twee gewonden en twee sham DRG van elk dier voor een totaal van 4 dieren).
- Kort centrifuge van de DRG, verwijder dan zorgvuldig de HBSS en voeg 500 ul van 1% formaldehyde in PBS + proteaseremmers cocktail en het monster gedurende 30 minuten incuberen bij 37 ° C.
Belangrijke stap. Gebruik verse, moleculaire biologie kwaliteit formaldehyde.
- Voeg 125 mM glycine van de fixatie en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur te stoppen.
- In het kort centrifuge, aspiratie af buffer, en tweemaal was het weefsel met 500 ul ijskoude PBS + proteaseremmers cocktail.
3. Kernen voorbereiding en chromatine afschuiving
- Aspireren uit PBS, voeg 400 ul van de SDS-lysis buffer, over te dragen aan een pre-gekoelde microcentrifugebuis, en verstoren het weefsel met ongeveer 30 slagen met de micropestle.
Belangrijke stap. Lysis en verstoring van het weefsel zijn van levensbelang voor een goede opbrengst van verknoopt chromatine.
- Ultrasone trillingen het monster met 8 pulsen, 10 seconden elk op 70% vermogen (Bandelin, Sonoplus GM70).
LET OP. Het afschuiven van het chromatine moet worden geoptimaliseerd voor uw specifieke ultrasoonapparaat ingesteld en een goede versnippering van de chromatine moet worden gecontroleerd voordat u het eigenlijke IP-experiment (zie hoofdstuk 3).
NOTE. Fragmentatie van de chromatine kan ook worden uitgevoerd door micrococcal nuclease (MNase) spijsvertering. Als een vuistregel, is fragmentatie door sonicatie voorkeur voor vaste weefsel, terwijl MNase spijsvertering is de voorkeur voor inheemse weefsel chromatine immunoprecipitatie. Verknoopt, kan geschoren chromatine worden bewaard bij -80 ° C tot 2 maanden, maar voorkomen dat herhaalde vries / dooi cycli.
4. Analyse van de chromatine spijsvertering (aanbevolen)
- Verwijder de 10 ul van je geschoren chromatine monster voor analyse. Voeg 200 mM NaCl aan het monster en omgekeerd de cross-link door incubatie bij 65 ° C voor 2 uur.
- Zuiver DNA (zie paragraaf 8) en uitvoeren van een 1% agarose gel. DNA moet worden versnipperd tot een lengte van ongeveer 200-1000 bp (figuur 1).
LET OP. Over-versnippering van chromatine kan leiden tot een verminderde signaal, terwijl de onvolledige fragmentatie zal leiden tot een verminderde resolutie en meer achtergrond.
5. Immunoprecipitatie
- Bepaal het aantal immunoprecipitatie reacties (zie opmerking hieronder), en verdelen samples even in nieuwe buizen. Breng het volume van elktot 500 pi met chip buffer + proteaseremmers cocktail.
- Verwijder de 5 pi van uw verdund monster en doe in een nieuwe buis. Dit is je 1% inbreng monster en het zal worden opgeslagen bij -20 ° C totdat het nodig is (hoofdstuk 7).
- Voor elke immunoprecipitatie, toe te voegen juiste antilichaam of normale IgG-controle en incuberen bij 4 ° C gedurende de nacht met rotatie.
NOTE. Bij de vaststelling van het aantal immunoprecipitatie, een positieve controle (bijv. histon H3-antilichaam) en een negatieve controle (normaal IgG) moet worden overwogen. De hoeveelheid antistof gebruikt voor elk IP varieert van antilichamen en dient empirisch te worden bepaald. Het is echter meestal binnen een range van 2-10? G / immunoprecipitatie.
- Om immunoprecipitaat uw antilichaam / eiwit / DNA-complex, voeg 30 ul van ChIP Grade Proteïne G magnetische korrels en incubeer gedurende 2 uur bij 4 ° C met rotatie.
6. Het wassen
- Naar pull-down gebonden chromatine-bead complex, plaats de buis op de magnetische rek. Wacht tot de oplossing helder is en verwijder dan zorgvuldig uw supernatant.
- Voeg 1 ml van een laag zout wassen (ChIP buffer) aan de kralen en incuberen bij 4 ° C gedurende 3-5 minuten met de rotatie, dan pull-down kralen en afwassen aspireren zoals in stap 6.1. Herhaal deze stap voor een totaal van drie wasbeurten.
- Voeg 1 ml van hoog zoutgehalte wasbuffer (ChIP buffer + 350 mM NaCl) aan de kralen en incubeer gedurende 3-5 minuten met de rotatie, dan pull-down kralen en afwassen aspireren zoals in stap 6.1.
7. Elutie en omkering van cross-linking
- Neem uw input samples uit de -20 ° C, voeg 150 ul van ChIP elutiebuffer en laat op kamertemperatuur tot Stap 7.5.
- Voeg 150 ul van 1 x ChIP elutiebuffer voor elk IP-monster uit stap 6.3.
- Plaats de buizen in een Thermomixer en elueer het chromatine van de kralen door incuberen monsters bij 65 ° C gedurende 30 minuten met zachte vortexen.
- Pull-down kralen op de magnetische rek, en zorgvuldig overdracht van de geëlueerde chromatine (supernatant) in nieuwe buizen.
- Om alle tubes, met inbegrip van uw inbreng monsters, voeg 200mm van NaCl en 40 ug / reactie van proteïnase K en incubeer bij 65 ° C gedurende 2 uur.
OPMERKING. De elutie stap kan worden uitgevoerd bij kamertemperatuur, ook, maar het kan niet zo efficiënt.
8. DNA-herstel
- Voeg een volume van Fenol / Chloroform om uw monsters van stap 7.5 en vortex gedurende 30 seconden.
- Centrifugeer op maximale snelheid in een microcentrifuge bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
- Voorzichtig te herstellen van de waterige (bovenste) fase in nieuwe buizen, voeg een volume van chloroform aan de waterfase, en vortex gedurende 30 seconden.
- Centrifugeer op maximale snelheid in een microcentrifuge bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
- Voorzichtig te herstellen van de waterige (bovenste) fase in nieuwe buizen, voeg dan 300mm van NaOAc, 20 ug / reactie van glycogeen, en 2,5 volumes van ijskoude 100% ethanol.
LET OP. De toevoeging van een drager, zoals het glycogeen, is nodig om de neerslag van relatief kleine afmetingen DNA-fragmenten te verbeteren.
- Incubeer bij -80 ° C gedurende 2 uur om neerslag DNA.
OPMERKING. De neerslag stap kan ook 's nachts worden uitgevoerd bij -20 ° C.
- Centrifugeer de monsters op maximale snelheid in een microcentrifuge gedurende 20 minuten bij 4 ° C.
- Verwijder voorzichtig het supernatant af en was het neergeslagen DNA-pellets met 300 ul ijskoude 70% ethanol.
- Centrifugeer de monsters op maximale snelheid in een microcentrifuge gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
- Verwijder voorzichtig zoveel mogelijk supernatant en laat de pellets lucht drogen.
- Resuspendeer in 20 ul van steriele H 2 O. Monsters zijn nu klaar voor PCR, of het DNA kan worden opgeslagen bij -20 ° C.
9. Representatieve resultaten
Een vertegenwoordiger resultaat van een experiment in ChIP DRG volgende ischiadicus letsel is weergegeven (figuren 1 en 2). Eerst tonen we gefragmenteerd DNA tot een lengte van ongeveer 200-1000 bp (figuur 1). Ten tweede, demonstreren we een PCR-signaal na chip van de proximale promotor van de groei geassocieerde proteïne-43 (GAP-43) alleen op heupzenuw letsel (laan 4, figuur 2, 5 '). Er geen PCR signaal aanwezig is wanneer het dier een schijnvertoning schade alleen ontvangt (laan 3), en bij gebruik van normale IgG serum voor de IP (baan 5 en 6). Om te testen voor de specificiteit van het antilichaam, analyseerden we hetzelfde DNA-monsters, maar gebruikte een controle primer set, die een gebied ontdekt in de 3'-UTR van onze gen van belang waar geen bewoning wordt verwacht. PCR-signalen ontbreken van alle rijstroken (lanen 3-6, Figuur 2, 3 '), behalve voor het ingangssignaal, die non-IP-DNA-monsters als standaard PCR-controles (laan 1-2, FIGUAd 2). Deze chip procedure kan worden uitgevoerd na een heup-of spinale dorsale kolom letsel zoals samengevat in een schema (figuur 3).
Figuur 1. Agarose gel van omgekeerde cross-linked DNA dat door sonicatie geschoren om de goede reeks van fragment lengtes.
Figuur 2. Semi-kwantitatieve PCR-resultaten van DRG weefsel volgende heupzenuw letsel waaruit blijkt dat geacetyleerde p53 bindt aan de GAP-43 proximale promotor regio 48 uur na letsel aan de heupzenuw. Controle PCR uit dezelfde DRG weefsel laten zien dat geacetyleerde p53 niet binden aan een controle gebied van DNA bevindt zich in het 3'-onvertaalde gebied (UTR) van het GAP-43 gen (S = Sham, I = Gewond).
Figuur 3. Een algemeen schema waaruit de ligging van de laesie sites op het heupzenuw, en de dorsale kolom.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit protocol biedt een methode om direct over de chromatine-omgeving te vragen tijdens de axonale regeneratie in het volwassen zenuwstelsel na axonale schade. Het bevat de DRG letsel model met chromatine immunoprecipitatie te probe de transcriptie en epigenetische omgeving na letsel aan de PNS of CNS niet. Het is met name nuttig voor onderzoekers die graag vermoedelijke bindingsplaatsen voor hun favoriete transcriptiefactor karakteriseren, en te bepalen of de bezetting van deze sites gebeurt in reactie op de blessure. E...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
We willen graag Andrea Tedeschi bedanken voor de hulp bij het bepalen van de aanvankelijke ChIP experimenten in het laboratorium en Ricco Lindner voor zijn bijdrage te fine-tunen van de voorwaarden voor Chip. Dit werk werd ondersteund door de Hertie Stichting; de Fortune Grant, de Universiteit van Tübingen, en de DFG DI 1497/1-1 subsidies (alle toegekend aan Simone Di Giovanni).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Reagens | Vennootschap | Catalogus nummer | |
| 10x ChIP Buffer | Cell Signaling | 7008 | |
| 2x ChIP elutiebuffer | Cell Signaling | 7009 | |
| ChIP Grade Proteïne G Magnetic Beads | Cell Signaling | 9006 | |
| Magna Grip Rack (8 goed) | Millipore | 20-400 | |
| Chloroform | MERCK | UN 1888 | |
| 37% Formaldehyde | ROTH | CP10.1 | |
| 10x Glycine Solution | Cell Signaling | 7005 | |
| Glycogeen | Sigma | G1767 | |
| 10x HBSS | Gibco | 14185 | |
| Histon H3 antilichaam (konijn) | Cell Signaling | 2650 | |
| Normaal Rabbit IgG | Cell Signaling | 2729 | |
| Fenol / chloroform / isoamylalcohol | ROTH | A156.1 | |
| Proteaseremmers Cocktail Tabletten | Roche | 04 693 116 001 | |
| Proteinase K (20 mg / ml) | Cell Signaling | 10012 | |
| SDS Lysis Buffer | Upstate | 20-163 |
| Apparatuur nodig |
|---|
| Ultrasoonapparaat |
| Micropestle |
| Microcentrifuge |
| Thermomixer |
Referenties
- Beirowski, B. Quantitative and qualitative analysis of Wallerian degeneration using restricted axonal labelling in YFP-H mice. Journal of Neuroscience Methods. 134, 23-35 (2004).
- Carey, M. F. Chromatin immunoprecipitation (ChIP). , Cold Spring Harb. Protocol. (2009).
- Dahl, J. A. A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (μChIP. Nat. Protoc. 3, 1032-1045 (2008).
- Haring, M. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 11, 3-11 (2007).
- Jiang, Y. Isolation of neuronal chromatin from brain tissue. BMC Neurosci. 9, 42-42 (2008).
- Lee, A. Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum. Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).
- Makwana, Molecular mechanisms in successful peripheral regeneration. Febs J. 272, 2628-2638 (2005).
- Tedeschi, A. A p53-CBP/p300 transcription module is required for GAP-43 expression, axon outgrowth, and regeneration. Cell Death and Differentiation. 16, 543-554 (2009).
- Teng, F. Y. Axonal regeneration in adult CNS neurons--signaling molecules and pathways. J Neurochem. 96, 1501-1508 (2006).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
