Kosteneffectieve methode voor Microbiële Source Tracking Met behulp van specifieke menselijke en dierlijke virussen

Summary

De studie beschrijft een kosteneffectieve methode voor de identificatie van de bron van fecale / urine besmetting of verontreiniging door nitraten in het water met behulp van qPCR voor de specifieke kwantificering van de mens / varkens / rund DNA-virussen, adenovirussen en polyomavirussen, voorgesteld als MST tools.

Abstract

Microbiële besmetting van het milieu is een belangrijke risico voor de gezondheid. Klassieke bacteriële fecale indicatoren getoond om significante beperkingen hebben, virussen beter bestand tegen vele inactivatie processen en standaard fecale indicatoren niet te informeren over de bron van besmetting. De ontwikkeling van kosteneffectieve methoden voor de concentratie van virussen uit het water en moleculaire assays vergemakkelijkt de toepasbaarheid van virussen als indicatoren van fecale verontreiniging en als microbiële bron tracking (MST) tools. Adenovirussen en polyomavirussen zijn DNA-virussen infecteren specifieke gewervelde diersoorten waaronder de mens en zijn voortdurend uitgescheiden in de feces en / of urine in alle bestudeerde geografische gebieden. In eerdere studies, hebben we voorgesteld de kwantificatie van menselijke adenovirussen (HAdV) en JC polyomavirussen (JCPyV) met behulp van kwantitatieve PCR (qPCR) als een index van de menselijke fecale verontreiniging. Onlangs hebben we qPCR assays voor de specifieke kwantificering van porcine adenovirussen (PAdV) en runderen polyomavirussen (BPYV) als dierlijke fecale markers van besmetting met de gevoeligheden van 1-10 exemplaren van het genoom per reageerbuis. In deze studie presenteren we de procedure die moet worden gevolgd om de bron van de besmetting van water monsters met behulp van deze tools te identificeren. Als voorbeeld van de representatieve resultaten, is de analyse van virussen in het grondwater de presentatie van een hoog niveau van nitraten getoond.

Detectie van virussen in een laag of matig vervuild water vereist dat de concentratie van de virussen uit ten minste een aantal liter water in een veel kleiner volume, een procedure die gewoonlijk bestaat uit twee stappen concentratie in serie. Deze ietwat omslachtige procedure en de variabiliteit waargenomen in virale terugvorderingen aanzienlijke mate zullen belemmeren gelijktijdige verwerking van een groot aantal watermonsters.

Om het knelpunt veroorzaakt door de twee voor-stap procedures die we hebben toegepast een een-stap protocol ontwikkeld in de vorige Studie te eliminerens en van toepassing zijn op een diversiteit aan water matrices. De procedure bestaat uit: verzuring van de tien-liter watermonsters, uitvlokking door magere melk, de zwaartekracht sedimentatie van de geflocculeerd materialen, de inning van de neerslag en centrifugeren, resuspensie van de neerslag in 10 ml fosfaatbuffer. De virale concentraat wordt gebruikt voor de winning van virale nucleïnezuren en de specifieke adenovirussen en polyomavirussen van belang zijn gekwantificeerd door qPCR. Groot aantal monsters kan tegelijkertijd worden geanalyseerd met deze low-cost concentratie-methode.

De procedure is toegepast op de analyse van het zwemwater, zeewater en rivierwater en in deze studie, presenteren wij de resultaten analyseren van grondwatermonsters. Deze high-throughput kwantitatieve methode is betrouwbaar, eenvoudig en kosteneffectief.

Protocol

1. De concentratie van de virale deeltjes in het water monsters

1. Verzamelen en conditioneren van watermonsters
   1. Verzamel een minimum van 2 herhalingen van 10 L per monster in plastic containers met vlakke bodem en een extra monster als een proces controle. Dit laatste monster wordt verrijkt met een bekende hoeveelheid van virale deeltjes en gebruikt als een controle.
      Opmerking: Het is aan te raden om speciale aparte materiaal (flessen, buizen, enz.) voor spiked samples hebben.
   2. Controleer de kalibratie van de conductimeter en indien nodig opnieuw kalibreren. Bereid een negatieve controle met behulp van leidingwater eerder aangepast a....

Discussion

De beschreven procedure zou voldoen aan de voorwaarden voor een passende methode voor routinematige milieu en volksgezondheid laboratoria: reproduceerbaar, betrouwbaar, eenvoudig en kosteneffectief. Het protocol is eenvoudig, maar het moet zorgvuldig worden gevolgd. Lage geleidbaarheid in de monsters zonder toevoeging van de gevraagde concentratie van kunstmatig zeewater zouten zou drastisch verminderen van het herstel van virussen zoals het geval zou zijn indien het roeren tijd voor flocculatie wordt aanzienlijk .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Naam van het reagens	Vennootschap	Catalogus nummer	Reacties
Hoge snelheid centrifuge (8000 xg)	Berckman Coulter	Avanti J-20XP
pH-meter, thermometer en conductimeter	Afora	LPPC3003
Plastic buizen 100-200 cm lengte	DeltaLab	350059
Steriele afgestudeerd wegwerp pipetten	Labclinics	PN10E1
Steriele plastic buizen van 1,5 en 10-15 ml (Eppendorf, Valken, etc.)	Afora	KA298/00
Centrifuge potten (500 ml)	Fisher Scientific	SE5753512
Magnetische roerders en magneten (een permonster)	Fisher Scientific	10510
Glas of plastic containers met platte bodems om het gebruik van magnetische roerders maken	DeltaLab	191642
Een peristaltische pomp voor het verwijderen van het supernatant (of een water-jet vacuümpomp)	Watson-Marlow	323E / D
Timer om uitschakeling van de roeren na 8-10 uur	DeltaLab	900400
Zoutzuur (1 N en 0,1 N)	Panreac	141020.1611
Natriumhydroxide (1 N)	Panreac	131687.1211
Kunstmatig zeewater zeezouten	Sigma	S9883
Magere melk (SM)	Difco	232100
Fosfaatbuffer pH 7, 5			01:02 v / v van steriele Na 2 HPO 4 0,2 M en NaH 2 PO 4 0,2 M bij pH 7,5
Thiosulfaat	Panreac	121879.1209	Maak een 10% oplossing in water
QIAamp Virale RNA Mini Kit	Qiagen	52904
96-well plaat optische reactie (500 eenheden)	Applied Biosystems	43426659
Optische lijm covers (100 eenheden)	Applied Biosystems	4311971
TaqMan PCR Master Mix Milieu 2x	Applied Biosystems	4396838